人类Tudor-SN蛋白表达抑制MDA-MB-231稳定株的建立及鉴定

论文摘要

研究目的：乳腺癌（Breast Cancer, BC）是女性最常见的恶性肿瘤之一,已成为全球范围内发病率最高的女性恶性肿瘤之一。和其它实体瘤相似,乳腺癌也具有很强的远处转移的倾向,如转移到肺、肝和骨等部位。Tudor-SN（tudor staphy-lococcal nuclease）蛋白表达于乳腺上皮细胞,主要分布于胞浆内质网和细胞器中。Ho J等学者根据质谱分析技术对小鼠乳腺癌转移模型进行分析,并结合临床转移性乳腺癌组织标本,发现转移性乳腺癌组织中高表达Tudor-SN蛋白。但是Tudor-SN蛋白如何影响乳腺癌的生物学行为,及相关的分子机制不清楚。本课题的研究目的旨在建立人类Tudor-SN蛋白表达抑制MDA-MB-231稳定株,揭示Tudor-SN蛋白对高转移乳腺癌细胞生物学的影响及相关机制的初探,从而为乳腺癌的诊断和治疗提供一定的实验依据。研究方法：本课题分为三个部分进行研究：第一部分,应用lipofectamine-2000转染试剂将质粒pGenesil-shRNA-hTudor-SNI转染高转移性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231, G418筛选阳性克隆。第二部分Tudor-SN蛋白对乳腺癌细胞生物学行为的影响,分别应用Transwell小室体外侵袭实验、伤口愈合实验等,观察Tudor-SN蛋白稳定抑制表达细胞株和MDA-MB-231细胞体外侵袭能力、迁移能力的差异。第三部分,应用实时荧光定量PCR方法检测Tudor-SN蛋白稳定抑制表达细胞株和MDA-MB-231细胞中MMP-2和MMP-9mRNA水平影响,及小鼠乳腺癌组织稳定抑制表达组和未处理组MMP-2和MMP-9mRNA水平的影响。研究结果：①第一部分通过倒置荧光显微镜肉眼观察并挑选出生长状态好、荧光强的单克隆细胞株。经PCR技术及western技术鉴定,pGenesil-shRNA-hTudor-SNI转染组细胞Tudor-SN mRNA及蛋白表达量均明显低于pGenesil-shRNA-HK阴性对照组细胞和／或未转染的对照组细胞,显示pGenesil-shRNA-hTudor-SNI稳定株细胞筛选成功。②第二部分结果表明：（1）pGenesil-shRNA-hTudor-SNI转染组细胞侵袭能力低于未转染的对照组细胞；（2）pGenesil-shRNA-hTudor-SNI转染组细胞迁移能力低于未转染的对照组细胞。③第三部分结果表明：实时荧光定量PCR技术鉴定,Tudor-SN稳定表达抑制细胞株中MMP-2mRNA水平低于未转染的对照组细胞,MMP-9mRNA水平高于未转染的对照组细胞；小鼠乳腺癌组织Tudor-SN抑制组MMP-2mRNA低于未处理组,MMP-9mRNA水平高于未转染的对照组细胞,细胞和组织水平结果一致。结论：①成功筛选出pGenesil-shRNA-hTudor-SNI稳定抑制表达MDA-MB-231细胞株。②Tudor-SNI稳定表达抑制组细胞与空白对照组细胞相比,体外侵袭能力和迁移能力降低,Tudor-SN对乳腺癌细胞的体外侵袭能力和迁移能力具有促进作用。说明Tudor-SN可能与乳腺癌细胞侵袭能力和迁移能力有关。③Tudor-SN可以上调人乳腺癌细胞和小鼠乳腺癌组织MMP-2mRNA水平,下调人乳腺癌细胞和小鼠乳腺癌组织MMP-9mRNA水平,为进一步研究Tudor-SN对乳腺癌侵袭和转移过程中的分子机制提供实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、人类Tudor-SN蛋白表达抑制稳定细胞株的构建
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 细菌和质粒
• 1.1.3 细胞
• 1.1.4 主要溶液、缓冲液与培养基
• 1.1.5 主要仪器和设备
• 1.1.6 引物
• 1.1.7 方法及流程
• 1.1.8 针对人类Tudor-SN cDNA的siRNA、vector序列
• 1.1.9 质粒提取
• 1.1.10 细胞培养
• 1.1.11 RNAi质粒的细胞转染
• 1.1.12 G418 筛选
• 1.1.13 稳定表达细胞株的鉴定一 PCR、免疫印迹（Western Blot）
• 1.2 结果
• 1.2.1 Tudor-SN蛋白表达抑制稳定细胞株的荧光鉴定
• 1.2.2 Tudor-SN蛋白表达抑制稳定细胞株的PCR,western鉴定
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、Tudor-SN蛋白对乳腺癌细胞生物学行为的影响
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 细胞
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 Tudor-SN对乳腺癌细胞体外侵袭能力的影响
• 2.2.2 Tudor-SN对乳腺癌细胞体外侵袭能力的影响
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、Tudor-SN蛋白对乳腺癌细胞及组织基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9mRNA表达的影响
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 细胞
• 3.1.3 引物
• 3.1.4 主要溶液
• 3.1.5 仪器
• 3.1.6 实验方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 基质金属蛋白酶与恶性肿瘤侵袭和转移关系的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢