猪CARD6、CARD7和RIP2基因克隆及序列分析研究

论文摘要

CARD6蛋白广泛存在于除脑组织以外的所有组织中,在心肌和骨骼肌组织中表达最多,它存在于细胞核和核DNA中。CARD6通过调节RIP激酶家族的功能来调节NF-κB激活作用,由于受到CARD4,Rip2的抑制作用的影响,CARD6基因作为NF-κB激活作用的选择性调节因子,与CARD家族的所有成员一道,共同参与机体的炎症应答和遗传性免疫调节。CARD7（又称NALP1/DEFCAP/NAC）是NOD家族中唯一含有N末端pyrin区域,同时连接着NBD-LRR和C末端CARD区域的蛋白,由"apoptosome"和"inflammasome"组成的大蛋白合成物,CARD7的mRNA在各种组织中广泛表达,在血粒细胞、胸腺、脾和心脏中表达最高,在脱噬作用、炎症性胱门蛋白酶激活和胱门蛋白酶原-1β进程中均扮演着重要作用。RIP2是核苷酸结合寡聚化结构域胞浆蛋白家族成员之一,它是一种在C终点含有氨基末端激酶域的丝氨酸/苏氨酸激酶,介于激酶域和CARD域之间的媒介领域。其生理和病理作用是调解参与多个NF-κB的活化,对先天的和适宜性免疫反应具有重要意义的信号转导途径。本研究应用比较基因组学的相关原理和方法,利用猪CARD6基因、CARD7基因和RIP2基因的mRNA序列,采用RT-PCR法,首次得到了猪相应基因的CDS部分序列。同时利用GENBANK数据库中不同物种三种基因的CDS区域序列及氨基酸序列,运用Mega4.0软件构建三种基因DNA序列的NJ关系树。结果显示:（1）从猪骨骼肌组织中克隆得到了2222bp的猪CARD6基因cDNA序列,与人、猩猩、牛、马及鼠的核苷酸同源性分别为:82.5%、82.6%、85.3%、84.0%及71.7%,氨基酸同源性分别为:72.4%、72.3%、78.1%、73.8%及61.6%。（2）从猪肾脏组织中克隆得到了一个1836bp的猪CARD7基因cDNA序列,与人、牛、猩猩及鼠的核苷酸同源性分别为:74.3%、78.4%、74.6%及62.0%,氨基酸同源性分别为:52.3%、58.9%、52.5%及46.7%。（3）从猪脑组织中克隆得到了一个1511bp的猪RIP2基因cDNA序列,与人、牛、狗及鼠的核苷酸同源性分别为:89.1%、89.7%、88.8%及82.5%,氨基酸同源性分别为:87.4%、87.4%、85.6%及82.4%。（4）猪的CARD6基因、CARD7基因和RIP2基因核酸序列和氨基酸序列聚类图中都是牛与猪的有关基因聚为一类。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 选题的背景及意义
• 1.2 NOD家族概述
• 1.2.1 NOD家族成员的结构
• 1.2.2 NOD蛋白的作用
• 1.2.2.1 诱导NF-κB的激活
• 1.2.2.2 介导细胞凋亡
• 1.2.3 NOD1及NOD2作为细胞内模式识别受体
• 1.2.4 NOD蛋白信号通路
• 1.2.5 NOD蛋白与疾病
• 1.3 CARD6基因概述
• 1.4 CARD7基因概述
• 1.5 RIP2基因概述
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 网络资源及应用软件
• 2.4 实验试剂
• 2.5 常用试剂的配制
• 2.6 实验方法
• 2.6.1 总RNA的提取
• 2.6.2 RNA的检测
• 2.6.3 引物设计
• 2.6.4 反转录反应cDNA第一条链合成
• 2.6.4.1 RT反应液的配制
• 2.6.4.2 反转录反应条件
• 2.6.5 PCR扩增
• 2.6.5.1 反应体系
• 2.6.5.2 反应条件
• 2.6.6 目的片段的胶回收
• 2.6.7 RT-PCR产物克隆
• 2.6.7.1 RT-PCR产物与PMD18-T载体连接
• 2.6.7.2 连接产物的转化
• 2.6.8 扩增子鉴定
• 2.6.9 质粒提取
• 2.6.10 测序
• 2.6.11 序列分析及基因进化分析
• 2.6.12 氨基酸组成分析
• 3 结果与分析
• 3.1 CARD6基因克隆和序列分析
• 3.1.1 猪骨骼肌中总RNA的提取
• 3.1.1.1 从猪骨骼肌、肾脏及脑组织中提取的总RNA
• 3.1.2 CARD6基因RT-PCR扩增
• 3.1.3 CARD6基因CARD6基因胶回收
• 3.1.4 CARD6基因重组菌液PCR的鉴定
• 3.1.5 CARD6基因序列分析
• 3.1.5.1 CARD6基因的序列测定及同源性分析
• 3.1.5.2 CARD6基因的分子进化分析
• 3.1.5.3 CARD6基因的氨基酸组成分析
• 3.2 CARD7基因克隆和序列分析
• 3.2.1 猪肾脏组织中总RNA的提取
• 3.2.2 CARD7基因RT-PCR扩增
• 3.2.3 CARD7基因胶回收
• 3.2.4 CARD7基因重组菌液PCR的鉴定
• 3.2.5 CARD7基因序列分析
• 3.2.5.1 CARD7基因的序列测定及同源性分析
• 3.2.5.2 CARD7基因的分子进化分析
• 3.2.5.3 CARD7基因的氨基酸组成分析
• 3.3 RIP2基因克隆和序列分析
• 3.3.1 猪脑组织中总RNA的提取
• 3.3.2 RIP2基因RT-PCR扩增
• 3.3.3 RIP2基因胶回收
• 3.3.4 RIP2基因重组菌液PCR的鉴定
• 3.3.5 RIP2基因序列分析
• 3.3.5.1 RIP2基因的序列测定及同源性分析
• 3.3.5.2 RIP2基因的分子进化分析
• 3.3.5.3 RIP2基因的氨基酸组成分析
• 4 讨论
• 4.1 CARD6基因
• 4.2 CARD7基因
• 4.3 RIP2基因
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢