论文摘要
本课题旨在追踪壁虎抗肿瘤物质基础,对主要抗肿瘤活性大分子进行分离纯化研究,并初步探讨壁虎抗肿瘤蛋白组分的药理作用机制。采用小鼠移植性肿瘤H22进行壁虎鲜品与炮制品水提物体内抗肿瘤活性研究;用MTT法比较壁虎鲜品与炮制品水提物对多种肿瘤细胞体外增殖抑制情况。实验结果可看出,壁虎鲜品与炮制品对体内外肿瘤皆有抑制生长作用,但无显著性差异。干品不同浓度组的脾指数和胸腺指数与阳性药物组相比明显增大（P<0.01或P<0.05）;而鲜品只有低剂量组的脾指数较阳性对照组升高（P<0.05）,鲜品中、高剂量组的胸腺指数较阳性对照组明显升高（P<0.01）。说明壁虎炮制品对实验动物的免疫力有一定的增强作用。由于鲜品的获得受季节影响,且运输、贮存不便,传统中医也多用炮制品入药,且炮制品有提高免疫力的作用,因此选取壁虎的炮制品进行深入研究。比较水提取物、乙醇提取物及水提物对肿瘤细胞的生长抑制情况,发现不同组分均有抗肿瘤活性。可能是多种成分共同起作用。从大量文献报道看,大多数动物药中的抗肿瘤活性成分为多肽或蛋白质类物质。壁虎中主要成分是蛋白质,所以对壁虎提取物中蛋白类成分的抗肿瘤活性成分进行研究。深入进行壁虎抗肿瘤蛋白的分离纯化研究,首先用硫酸铵分级沉淀对壁虎粗提物进行分离。将粗提液分为四个沉淀级别,并进行了其中三个沉淀组分的细胞药效比较,选出硫酸铵组分得率高,细胞药效佳的组分进行下一步实验。40%沉淀中蛋白质含量少,含有大量油脂性成分。60%和80%的沉淀组分中蛋白质含量较高,加药后观察细胞形态发现可使细胞伸长。根据各项指标综合考虑,选择60%和80%组分进行下一步分离纯化研究。第二步用两种凝胶过滤层析介质对硫酸铵组分进行分离。从分离结果看,Sephadex G-25将样品分为三个峰,即三个组分;Sephadex G-75将样品分为两个峰。Sephadex G-25的分离效果较好,且将硫酸铵集中到第二个峰中,所以用Sephadex G-25进行分离,起到了分离除盐的作用。细胞药效实验中显示峰1（G1）的活性最强,选用G1进行下一步分离。而后分别用阳离子交换剂CM spharose Fast Flow和阴离子交换剂DEAE纤维素DE-52两种离子交换介质进行层析。结果:G1大部分组分不能吸附在CM spharose Fast Flow介质上,而可以被吸附在DE-52介质上,并可分离出较明显的两个峰。所以认为G1组分中绝大部分是酸性蛋白质,等电点小于7,不适合用阳离子交换剂分离。经过三步分离后纯化效果不理想,所以更换纯化路线。首先将硫酸铵分级沉淀细化,共分为7个沉淀级别,将其中6个级别做细胞药效实验,发现40%、80%、90%组分效果较好。从得率结果分析,40%得率最少,80%、90%组分得率较高,且有细胞伸长作用。因此选取70-90%组分进行深入纯化研究。用sephadex G-25分离70-90%组分,同样G1的细胞药效实验的结果最好。将G1组分用三种常用的疏水性差异较大的介质进行阶段洗脱分离,结果:三种介质都可以对G1进行分离,但上样量和各种填料所得组分得率不同。Phenyl FF的上样量最大,得率最高。从细胞药效实验结果看,各分离组分无明显差异。用SDS-PAGE电泳检查分离的效果,比较粗提物、硫酸铵沉淀70-90%、G1的电泳成分差异,发现各步分离都起到了纯化的效果。通过查阅文献发现,大多数抗肿瘤中药都有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,所分离的壁虎蛋白G1组分的抗肿瘤作用机制未见报道,所以首先从诱导凋亡的角度对此成分的作用机制进行研究。用形态学观察和流式细胞计数法来检测是否有诱导细胞凋亡作用。结果发现形态学观察其诱导凋亡作用不明显,流式细胞术检测其有一定的诱导凋亡的作用。由于时间有限,未对其进行其他检测以证明。须在以后的实验中进一步验证。