玫瑰MYB基因的克隆及超量表达载体的构建

论文摘要

玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）是蔷薇科蔷薇属的一种重要的观赏植物,花型秀美,芳香四溢,色彩绚丽。因其特有的芳香、花色及抗寒性、抗旱性,在环境条件日益恶化的今天,在园林应用中有着巨大的发展潜力。从玫瑰花瓣中提取的精油,是世界名贵的精油之一,素有“液体黄金”之称。然而,一直以来人们对玫瑰的研究还只是局限在栽培管理上,随着分子生物学和生物技术的迅猛发展,利用生物技术手段来改良植物性状也成为了可能。近年来,利用MYB类转录因子对观赏植物进行性状改良如花色、花香的研究,逐渐成为研究的热点。本研究采集玫瑰花瓣混合样进行转录组测序,并提取了高质量的花瓣混合样总RNA,反转录合成cDNA。从转录组测序结果中筛选出13个MYB基因的EST序列,以此设计引物,从玫瑰基因组DNA中扩增出每个MYB基因的gDNA片段。然后,采用TAIL-PCR技术对gDNA片段两侧的未知序列进行扩增,直至扩增出两端的UTR区。最后,在MYB基因两端的UTR区设计上下游引物,扩增玫瑰MYB基因的gDNA全长和cDNA全长。本研究挑选了6个MYB基因的全长分别构建超量表达载体,计划在后续的实验中转化野生烟草,研究其功能。本研究的主要结果如下：1.从转录组测序结果中,筛选出13个MYB基因,采用普通PCR和TAIL-PCR技术相结合的方法,扩增出全长。其中属于R1/R2类型的MYB基因有RrMYB8和RrMYB10,属于R2R3-MYB的有RrMYB1、RrMYB2、RrMYB3、RrMYB5、RrMYB6、RrMYB7、RrMYB9、RrMYB11、RrMYB12和RrMYB13,属于R1R2R3类型的MYB基因有RrMYB4。经过对NCBI上已报道的MYB基因进行蛋白质的氨基酸序列比对,发现扩增出的MYB基因中都包含DNA结合结构域等MYB基因的结构特点,初步认定所扩增出的基因均为MYB基因。2.本文构建了六个超量表达载体。选取R1/R2类型的RrMYB8基因的cDNA构建了pCAMBIA2300s-RrMYB8载体；选取R2R3类型的RrMYB1基因的cDNA、RrMYB2基因的gDNA、RrMYB5基因的gDNA、RrMYB6基因的cDNA和RrMYB7基因的cDNA,分别构建了PMV-RrMYB1载体、pCAMBIA2300s-RrMYB2载体、PMV-RrMYB5载体、PMV-RrMYB6载体和PMV-RrMYB7载体,并且把重组质粒电转化农杆菌EHA105保存。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 玫瑰简介
• 1.2 转录因子概述
• 1.3 MYB类转录因子的结构特征与分类
• 1.4 MYB类转录因子的功能及研究进展
• 1.4.1 调节植物次生代谢
• 1.4.2 调节植物细胞形态和模式建成
• 1.4.3 参与植物对环境胁迫的应答
• 1.4.4 参与植物对激素的应答
• 1.5 研究目的及意义
• 第二章 玫瑰MYB基因的克隆与分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.3 载体和菌株
• 2.2.4 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 玫瑰花瓣转录组测序
• 2.3.2 玫瑰花瓣高质量RNA的提取及纯化
• 2.3.3 玫瑰花瓣RNA反转录
• 2.3.4 玫瑰基因组DNA的提取
• 2.3.5 玫瑰MYB基因gDNA片段的扩增
• 2.3.6 用TAIL-PCR扩增gDNA片段两端的未知序列
• 2.3.7 玫瑰MYB基因gDNA全长和cDNA全长的扩增
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 玫瑰花瓣总RNA的检测
• 2.4.2 TAIL-PCR产物检测
• 2.4.3 玫瑰MYB基因序列分析
• 2.4.4 玫瑰MYB基因功能预测
• 2.5 讨论
• 2.5.1 玫瑰花瓣总RNA的提取
• 2.5.2 关于TAIL-PCR
• 2.5.3 植物MYB基因的进化
• 第三章 玫瑰MYB基因超量表达载体的构建
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株、质粒、酶、试剂
• 3.2.2 主要实验试剂的配置
• 3.2.3 实验仪器
• 3.2.4 实验所用引物序列
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 目的基因插入片段的获得
• 3.3.2 摇菌
• 3.3.3 质粒DNA的提取
• 3.3.4 酶切及产物回收
• 3.3.5 目的片段与表达载体的连接
• 3.3.6 连接产物转化大肠杆菌
• 3.3.7 重组质粒的筛选及鉴定
• 3.3.8 重组质粒酶切验证
• 3.3.9 重组质粒导入根癌农杆菌EHA105及筛选鉴定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 玫瑰MYB基因超量表达载体的构建
• 3.4.2 重组质粒转化农杆菌
• 3.5 讨论
• 第四章 前景展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢