逆转录病毒介导反义端粒酶RNA基因对肝癌细胞的影响

论文摘要

目的：研究逆转录病毒载体介导的反义端粒酶RNA基因对肝癌细胞的抑制作用，探讨通过抑制端粒酶活性治疗肝细胞癌的有效途径。方法：常规方法进行质粒提取，采用紫外分光光度计测定所提取质粒的浓度和纯度，并通过电穿孔法将携带正义和反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒真核表达载体质粒导入PT67包装细胞，G418筛选获得稳定产病毒细胞株，分别命名为PT67-hTR-EcoRI和PT67-hTR-BamHI；待细胞生长至对数生长期，收集逆转录病毒上清，超速离心获得浓缩逆转录病毒，采用NIH3T3细胞检测所收集逆转录病毒的滴度；用浓缩后的逆转录病毒感染HepG2肝癌细胞，G418筛选4周获得稳定转染目的基因的肝癌细胞克隆，分别命名为HepG2-hTR-EcoRI和HepG2-hTR-BamHI；挑取单个细胞克隆扩增培养，利用扩增端粒酶RNA基因的引物进行PCR鉴定；通过MTT法分别检测转染正义和反义端粒酶RNA基因组肝癌细胞（HepG2-hTR-EcoRI和HepG2-hTR-BamHI）以及未转染端粒酶RNA基因组肝癌细胞（HepG2）的生长曲线，并分析反义端粒酶RNA基因与化疗药物（5-氟尿嘧啶和顺铂）对于肝癌细胞的协同抑制作用；免疫荧光化学检测不同处理组肝癌细胞抗中性粒细胞核抗原（PCNA）的表达情况；TRAP-PCR-ELISA法检测各组细胞的端粒酶活性；流式细胞术检测细胞所处的细胞周期及凋亡率的改变。结果：PCR鉴定可于约500 bp处检测到目的基因的表达，证明基因转染成功；所收集的浓缩逆转录病毒滴度分别为0.95×106CFU／ml和1.1×106CFU／ml；反义端粒酶RNA基因治疗组肝癌细胞生长受到明显抑制，生长曲线较为平缓，细胞对顺铂（CDDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）的半数抑制浓度(IC50)分别为1.53μg／ml和3.41μg／ml，而对照组的半数抑制浓度分别为2.83μg／ml和6.44μg／ml，两者差别明显；转染反义端粒酶RNA基因组细胞的抗中性粒细胞核增殖抗原（PCNA）表达减少：端粒酶活性检测结果显示试验组细胞的吸光密度值为（2.31±0.16），较作为对照的转染正义端粒酶RNA基因的HepG2-hTR-EcoRI组细胞及未转染端粒酶RNA基因的HepG2组细胞明显下降（P＜0.01）；流式细胞术检测结果示试验组细胞的凋亡率为（9.58±1.38）％，与对照组相比差别具有显著性（P＜0.01），且试验组肝癌细胞可见G2／M期阻滞及凋亡峰。结论：端粒酶RNA（hTR）是端粒酶活性的一个重要组成部分，本研究数据显示通过反义技术下调其表达能够抑制肝癌细胞的生长增殖及诱导细胞凋亡，并能够提高肝癌细胞对于CDDP及5-FU的化疗敏感性，是一个重要的抗肿瘤基因治疗靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 符号说明
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 附表
• 综述 端粒酶的研究进展
• 致谢
• 攻读硕士学位期间撰写及发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表