哈尔滨产乙醇杆菌模式菌株YUAN-3Sau3AⅠ与PstⅠ酶切基因组文库的构建

论文摘要

哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3 （Ethanoligens harbinense）是本实验室从生物制氢反应器中分离得到的一株具有自凝集能力的高效产氢菌种,它的发酵过程不同于传统的丁酸型发酵体系,因而其产氢过程中很多机理亟需探讨。本课题的研究目的就是构建哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3菌株的Sau3A I和Pst I两个酶切基因组文库,应用两种酶切的基因组文库,构建基因筛选的平台,用于分离YUAN-3菌株的全长基因,以寻找各种目的基因,并为后期展开功能基因的研究打下良好的基础。分别采用四碱基识别位点的限制酶Sau 3A I和六碱基识别位点的限制酶Pst I作为工具酶,最大可能地含盖菌株基因组所有完整的目的基因片段,以pUC19质粒作为载体,经完全酶切和碱性磷酸酶处理后,分别与部分酶切的YUAN-3菌株基因组DNA 1000bp-3000bp的DNA片段连接,转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞,在含有Amp的LB平板上筛选重组子,随机挑取阳性克隆子,经DNA测序,在网络数据库中进行BLAST分析,得到一系列相似基因、蛋白的比对结果。这些结果为YUAN-3菌株的研究,提供了一条从分子水平上探讨的技术路线。文库的构建过程中,详细讨论了基因组部分酶切、载体完全酶切、去磷酸化等各项实验条件。菌株高浓度基因组样品的制备、重组体构建过程中DNA片段的最佳连接比例及宿主菌株对重组体所具有的高感受能力为基因组文库的完整性构建奠定了坚实的基础。文库构建完成后,分别从文库的代表性、重组DNA片段的序列完整性和多样性、文库的重组率三方面对其进行评价。两种酶切文库中的克隆子数目,符合L.Clarke和J.Carbon所提出的计算一个完整基因组文库所应该包含有实际克隆数的理论数值要求;双文库重组体中都含有长度不等的外源基因片段,其平均插入片段长度分别为1500bp和2500bp,具备完整基因组文库应包含核酸序列片段多样性和完整性的要求;其重组率分别为99%和98%,符合文库构建要求。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 本课题的研究目的和研究意义
• 1.3 氢能和生物制氢技术
• 1.3.1 氢能的制取技术
• 1.3.2 生物制氢技术
• 1.3.3 生物制氢的分子生物学研究
• 1.4 基因组文库的构建策略及其研究进展
• 1.4.1 克隆载体的发展
• 1.4.2 基因组文库的发展
• 1.4.3 基因组文库的构建策略
• 1.5 本课题的主要研究内容
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌种
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株YUAN-3 的培养条件
• 2.2.2 菌株YUAN-3 总DNA 的提取
• 2.2.3 总DNA 部分酶切和酶切片段的回收
• 2.2.4 PUC19 载体质粒的制备
• 2.2.5 PUC19 质粒的完全酶切和去磷酸化
• 2.2.6 感受态细胞的制备
• 2.2.7 连接和转化
• 2.2.8 检测
• 第3章 菌株YUAN-3 Sau3A I 酶切文库的构建
• 3.1 样品预处理菌株YUAN-3 高浓度基因组DNA 的制备
• 3.2 菌株基因组的Sau3A I 部分酶切条件的选择
• 3.3 载体PUC19 的Bam H I 完全酶切
• 3.4 载体PUC19 的Bam H I 完全酶切后去磷酸化
• 3.5 Sau3A I 酶切的基因组片段与载体重组
• 3.6 Sau3A I 文库中重组转化子筛选与鉴定
• 3.7 Sau 3A I 文库阳性克隆子的DNA 测序和BLAST 分析
• 3.8 菌株YUAN-3 Sau3A I 酶切基因组文库构建完整性评估
• 3.8.1 文库的代表性
• 3.8.2 重组DNA 序列片段的多样性和完整性
• 3.8.3 文库的重组率
• 3.9 本章小结
• 第4章 菌株YUAN-3 Pst I 酶切文库的构建
• 4.1 菌株基因组的Pst I 部分酶切条件的选择
• 4.2 载体PUC 19 的Pst I 完全酶切
• 4.3 载体PUC 19 的Pst I 完全酶切后去磷酸化
• 4.4 Pst I 酶切的基因组片段与载体重组
• 4.5 Pst I 酶切的文库中重组转化子的筛选与鉴定
• 4.6 Pst I 酶切的文库阳性克隆子的DNA 测序和BLAST 分析
• 4.7 菌株YUAN-3 Pst I 酶切基因组文库构建完整性评估
• 4.7.1 文库的代表性
• 4.7.2 重组DNA 序列片段的的多样性和完整性
• 4.7.3 文库的重组率
• 4.8 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢