论文摘要
植物细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility, CMS）是指植物雄性器官丧失功能,而雌性器官发育正常,表现为母性遗传的生物学现象。根据恢、保关系,水稻CMS可分为野败（wild abortive, WA）型、包台（Chinsurah Boro II, BT）型和红莲（Honglian, HL）型三种主要类型。由糖基转移酶（glycosyltransferases, GTs）催化的糖基化反应在原核和真核生物中都有着重要的生物学功能。GTs能将有活性的供体（通常是二磷酸核苷-糖）的单糖部分转移至受体上,受体可以是糖、脂类、蛋白质和核酸等。GTs在植物中多个方面起着关键的作用,比如调节代谢、调节激素活性水平、解毒、参与细胞壁合成等。在本实验室已克隆了一个HL-CMS相关基因orf216和烟草糖基转移酶基因sm-Ngt1的基础上,本研究将这两个目的基因克隆入原核表达载体进行高效表达,目的蛋白纯化后制备多克隆抗体。通过Western blot检测分析水稻和烟草植株中两个基因的表达。取得了以下研究结果。1.设计特异性PCR引物,通过PCR扩增得到orf216基因。将该基因克隆入含有内含肽标签的原核表达载体pTYB1中,得到重组质粒pTYB1-orf216,将重组质粒转化至大肠杆菌ER2566感受态细胞。为了高效表达orf216基因,进行诱导表达条件的优化,结果确定15℃0.8 mmol/L IPTG诱导15 h为蛋白诱导表达的优选条件。通过SDS-PAGE分析,在可溶性组分中检测到约85 kD的目的蛋白条带。目的蛋白采用亲和层析分离纯化,经N-端质谱鉴定后制备多克隆抗体。Western blot检测水稻组织中蛋白的表达,表明多克隆抗体具有较高的特异性。2.设计特异性PCR引物,通过PCR扩增得到sm-Ngt1基因。将该基因分别克隆入含有6×his标签的原核表达载体pET-30a、含有内含肽标签的原核表达载体pTYB1和含有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,得到重组质粒pET-smNgt1、pTYB1-smNgt1和pGEX-smNgt1,将重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21、ER2566和BL21感受态细胞。进行诱导表达条件的优化,结果确定15℃下0.8 mmol/L IPTG诱导20 h为pET-smNgt1诱导表达的优选条件,15℃下0.3 mmol/L IPTG诱导15 h为pTYB1-smNgt1诱导表达的优选条件,37℃下0.2 mmol/L IPTG诱导3 h为pGEX-smNgt1诱导表达的优选条件。通过SDS-PAGE分析,在沉淀中分别检测到约55 kD、100 kD和80 kD的蛋白条带,蛋白均为包涵体形式。包涵体用变性剂溶解后透析复性,经N-端质谱鉴定后制备多克隆抗体。Western blot分析表明多克隆抗体具有较高的特异性。
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相关论文文献
- [1].水稻HL-CMS中orf216蛋白的原核表达和多克隆抗体制备[J]. 华中农业大学学报 2010(03)
- [2].水稻HL-CMS中线粒体基因orf216原核表达载体构建及蛋白纯化[J]. 广东农业科学 2012(16)