甘草蛋白自组装行为研究

论文摘要

甘草是一味广泛使用的传统中草药,富含丰富的蛋白质。本文以甘草中的蛋白分子为研究对象,内容包括甘草饮片中天然蛋白质的分离纯化及性质表征,甘草蛋白自组装条件优化,纳米颗粒稳定性及药物包埋实验。从全新的角度阐释中草药中蛋白分子的自组装行为。经过抽提、乙醇沉降等前处理,先后通过High Q阴离子交换柱和POROS@R1疏水等色谱分离,从甘草饮片中得到一个新的蛋白分子GP。该蛋白分子在SDS-PAGE表现为单一条带,测得分子量为28.0 kDa。等点聚焦结果显示pI为4.5。N-端测序结果为NPDGLIACYCGQYCW,通过NCBI同源对比,未发现有相似序列的蛋白分子。利用动态光散射的方法,发现GP在浓度为0.9 mg/mL, pH7.9、100℃加热保持时间60 min条件下能得到平均粒径为74.09±0.69nm,Zeta电势绝对值为24.3±1.69 mV的纳米颗粒GPNs。运用SEM手段观察GPNs的形态特征,发现其颗粒外形呈近似球形。对GPNs组装率分析结果显示,有87.9%的GP参与了GPNs的自组装行为。利用凝胶过滤色谱及多角度激光光散射联用对GPNs分子大小进行估算。结果显示理想状态下,有22个GP组装成一个GPNs。对GPNs稳定性测试结果显示GPNs可在常温下短期保存,但可在低温下长期保存。细胞毒性实验结果显示,GP及GPNs均未对受试细胞株造成明显细胞毒性。。GPNs细胞结合特异性实验结果显示,GP未与实验细胞表面结合,GPNs则能有效的与实验细胞表面结合。利用动态光散射对包埋有药物分子的GPNs分析结果显示,包埋黄芪甲苷分子后,纳米颗粒粒径会一定程度的增大。经反相高效液相色谱法测定药物装载率为51.2%。本文利用从传统中药中获得的蛋白分子GP构建纳米颗粒GPNs,获得的GPNs有望成为一种新型的药物递送载体,同时为中药材的现代化研究开辟了新的模式。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 中药甘草概述
• 1.1.1 中药甘草简介
• 1.1.2 中药甘草化学成分
• 1.1.2.1 三萜类化合物
• 1.1.2.2 黄酮类化合物
• 1.1.2.3 多糖类化合物
• 1.1.2.4 其他成分
• 1.1.3 中药甘草药理活性研究进展
• 1.1.3.1 镇咳祛痰
• 1.1.3.2 解痉镇痛
• 1.1.3.3 抗炎及免疫调节作用
• 1.1.3.4 抗氧化、抗衰老
• 1.1.3.5 肾上腺皮质激素样作用
• 1.1.3.6 抗肿瘤、抗癌
• 1.1.3.7 抗病毒、抑菌
• 1.1.3.8 解毒作用
• 1.1.3.9 血脂调节及抗动脉粥样硬化
• 1.1.3.10 其他作用
• 1.2 中药与纳米颗粒
• 1.2.1 中药汤剂与难溶成分
• 1.2.2 中药汤剂中的胶束
• 1.2.3 中药与纳米技术
• 1.2.4 难溶性药物载体的蛋白质纳米颗粒
• 1.3 本文研究内容及意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料与设备
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 材料与试剂
• 2.1.2.1 主要材料
• 2.1.2.2 主要试剂
• 2.1.2.3 常用溶液及缓冲液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的蛋白的确定
• 2.2.1.1 甘草单煎液制备
• 2.2.1.2 SDS-PAGE分析
• 2.2.2 目的蛋白的获得
• 2.2.2.1 甘草蛋白粗提液制备
• 2.2.2.2 乙醇分级沉降
• 2.2.2.3 透析
• 2.2.2.4 离子交换
• 2.2.2.5 疏水色谱
• 2.2.3 甘草蛋白基本性质表征
• 2.2.3.1 分子量
• 2.2.3.2 等电点
• 2.2.3.3 序列
• 2.2.3.4 Folin-酚测定
• 2.2.4 甘草蛋白纳米颗粒构建
• 2.2.4.1 pH
• 2.2.4.2 温度
• 2.2.4.3 保持时间
• 2.2.5 GPNs表征
• 2.2.5.1 扫描电子显微镜观察GPNs
• 2.2.5.2 GPNs分子量计算
• 2.2.5.3 GPNs粒径分布
• 2.2.5.4 GPNs的Zeta电势分布
• 2.2.5.5 GPNS的SDS-PAGE分析
• 2.2.5.6 GPNs的组装率
• 2.2.5.7 GPNs粒径对pH的响应性
• 2.2.6 GPNs的稳定性
• 2.2.6.1 常温
• 2.2.6.2 低温保存
• 2.2.6.3 反复冻融
• 2.2.7 GPNs样品细胞实验
• 2.2.7.1 细胞毒性
• 2.2.7.2 细胞特异性
• 2.2.8 药物包埋
• 2.2.8.1 粒径变化
• 2.2.8.2 装载率计算
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 甘草蛋白的研究
• 3.1.1 目的蛋白的确定
• 3.1.1.1 甘草蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.1.1.2 小结
• 3.1.2 GP的获得
• 3.1.2.1 GP粗提液SDS-PAGE分析
• 3.1.2.2 GP粗提液乙醇沉降后SDS-PAGE分析
• 3.1.2.3 High-Q离子交换色谱
• 3.1.2.4 疏水色谱
• 3.1.2.5 小结
• 3.1.3 GP基本性质表征
• 3.1.3.1 分子量
• 3.1.3.2 等电点测定
• 3.1.3.3 序列测定
• 3.1.3.4 序列测定
• 3.1.3.5 小结
• 3.2 甘草蛋白纳米颗粒构建及表征
• 3.2.1 甘草蛋白纳米颗粒构建
• 3.2.1.1 pH的选择
• 3.2.1.2 温度的选择
• 3.2.1.3 保持时间的选择
• 3.2.1.4 小结
• 3.2.2 表征
• 3.2.2.1 扫描电子显微镜观察
• 3.2.2.2 分子量估算
• 3.2.2.3 GPNs粒径分布
• 3.2.2.4 GPNs的Zeta电势分布
• 3.2.2.5 GPNs的SDS-PAGE分析
• 3.2.2.6 GPNs的组装率
• 3.2.2.7 GPNs粒径对pH的响应性
• 3.2.2.8 小结
• 3.2.3 GPNs稳定性试验
• 3.2.3.1 常温保存
• 3.2.3.2 低温保存
• 3.2.3.3 反复冻融
• 3.2.3.4 小结
• 3.3 GPNs细胞活性及药物包埋
• 3.3.1 GPNs细胞试验
• 3.3.1.1 细胞毒性
• 3.3.1.2 细胞特异性
• 3.3.1.3 小结
• 3.3.2 药物包埋试验
• 3.3.2.1 粒径变化
• 3.3.2.2 装载率计算
• 3.3.2.3 小结
• 总结与展望
• 总结
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历