1.谷氨酸刺激引起泛素蛋白酶系统降解GRIP1可以影响AMPA受体在细胞膜的分布 2.泛素蛋白酶系统调节Akt分布影响海马神经元极性

论文摘要

谷氨酸受体相互作用蛋白1（GRIP1,glutamate receptor interacting protein 1）是在突触后致密区（PSD）高度分布的一类脚手架蛋白（scaffolding protein）。GRIP1可以直接与AMPA受体相互作用并将之与其它信号蛋白联结在一起。我们发现在体外培养的神经元中,谷氨酸刺激可以快速减少GRIP1的蛋白量,而AMPA受体的GluR1亚基,GluR2亚基,以及PICK1的蛋白量都没有明显变化。泛素蛋白酶的抑制剂MG132,epoxomycin或者转染显性失活突变的泛素质粒（K48R-ubiquitin）,都可以阻止谷氨酸刺激引起的GRIP1蛋白表达量的减少。GRIP1的降解可以被NMDA受体特异的拮抗剂MK801阻断,却不可以被AMPA受体的拮抗剂CNQX阻断。两种钙离子的螯合剂EGTA和BAPTA都可以阻断GRIP1的降解,而L型钙通道的阻断剂nifedipine却没有作用。另外,蛋白酶的抑制剂MG132可以阻止谷氨酸刺激引起的细胞膜表面GluR2的减少,用RNA干扰的方法来降低培养神经元中GRIP1的表达,可以减少细胞膜表面分布的GluR2。我们的这些结果表明谷氨酸刺激引起的泛素蛋白酶系统降解GRIP1是NMDA受体介导的,钙依赖的过程,并且泛素蛋白酶系统的激活以及GRIP1的降解对调节GluR2在细胞膜表面的分布有着作用。蛋白激酶B（Akt）和糖原合成激酶-3β（GSK-3β）的不对称激活对于神经元极性的建立非常关键。但是这条通路是如何在局部被特异性的调节仍然不清楚。我们通过一系列的实验发现通过泛素蛋白酶系统调节Akt的稳定性是对神经元极性建立和维持是必须的。在神经元极性建立过程中,Akt选择性的在那些将要成为树突的分支中降解。同时我们还通过激光激活的GFP融合的Akt蛋白直接证明了在极性建立过程中,Akt确实是选择性的只保留在轴突的尖端。如果我们抑制泛素蛋白酶系统就可以抑制Akt从发育中神经突起的尖端消失,从而使神经元长出多根长的轴突。这些结果证明了蛋白质的局部降解对于神经元极性的建立确实是必须的。

论文目录

• 前言
• （一） 论文摘要
• 第一部分
• 中文摘要
• Abstract
• 第二部分
• 中文摘要
• Abstract
• （二） 论文目录
• （三） 图表索引
• （四） 论文正文
• 第一部分 谷氨酸刺激引起泛素蛋白酶系统降解GRIP1 可以影响AMPA 受体在细胞膜的分布
• 1. 引言
• 1.1 突触（synapse）和突触后致密区（postsynaptic density，PSD）
• 1.2 突触后膜AMPA 受体的转运（trafficking）
• 1.3 与AMPA 受体相互作用的突触后蛋白
• 1.3.1 和具有短羧基末端的AMPA 受体相互作用的蛋白
• 1.3.2 与AMPA 受体亚基胞外段相互作用的蛋白
• 1.3.3 与AMPA 受体亚基胞外段相互作用的蛋白
• 1.3.4 Stargazin 和PSD-95 对AMPA 受体的调节
• 1.4 泛素蛋白酶系统（UPS）
• 1.4.1 泛素（Ubiquitin ,Ub）
• 1.4.2 泛素蛋白酶系统（UPS）介导的蛋白降解过程
• 1.4.3 蛋白质泛素化降解的作用意义
• 1.5 研究背景和创新
• 2. 实验方法和材料
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验用抗体
• 2.1.2.1 兔源的多克隆抗体（Rabbit polyclonal antibodies）
• 2.1.2.2 鼠源的单克隆抗体（Mouse monoclonal antibody）
• 2.1.2.3 二抗
• 2.1.3 实验试剂和材料
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 原代神经元细胞的体外培养和药物处理
• 2.2.2 反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 2.2.3 培养神经元的转染
• 2.2.4 PI 细胞染色
• 2.2.5 蛋白免疫印迹实验（Western blotting）
• 2.2.6 免疫沉淀（immunoprecipitation）
• 2.2.7 GST-55a pull down
• 2.2.8 免疫荧光细胞化学（Immunocytochemistry）
• 2.2.9 生物素-亲合素系统(biotin-avidin system，BAS 标记检测膜表面受体
• 2.2.10 统计与检验
• 3. 实验结果
• 3.1 谷氨酸刺激可以降低GRIP1 蛋白在培养原代神经元中的表达量
• 3.2 MG132 可以阻止谷氨酸刺激引起的GRIP1 蛋白表达水平降低
• 3.3 谷氨酸刺激引起的GRIP1 降解需要NMDA 受体的激活
• 3.4 UPS 和GRIP1 的表达水平可以影响AMPA 受体GluR2 亚基在膜的分布
• 4. 实验结果分析和讨论
• 5. 结论
• 6. 参考文献
• 第二部分 泛素蛋白酶系统调节Akt 分布影响海马神经元的极性
• 简介
• 一、泛素-蛋白酶系统的激活对神经元极性建立是必须的
• 二、泛素-蛋白酶系统的激活对神经元极性的保持也是必须的
• 三、Akt 蛋白可以选择性的在神经元的树突中被泛素-蛋白酶系统降解
• 四、抑制泛素蛋白酶系统可以破坏Akt/p-Akt 的不对称分布及神经元的极性
• 小结
• （五） 发表文章目录
• （六） 文献综述: 泛素-蛋白酶体系统及其功能作用
• 1. 前言
• 2. 泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system ,UPS）的研究历史
• 3. 泛素-蛋白酶体系统的组成
• 3.1 泛素（Ubiquitin，Ub）
• 3.2 泛素活化酶（Ubiquitin - Activating Enzyme， E1）
• 3.3 泛素结合酶（Ubiquitin - Conjugating Enzymes，E2s）
• 3.4 泛素蛋白连接酶（Ubiquitin - Protein Ligases，E3s）
• 3.5 去泛素酶（De-Ubiquitinating Enzymes，DUB）
• 3.6 26S 蛋白酶体系统
• 4. 泛素-蛋白酶体系统介导的蛋白降解的过程
• 4.1 泛素化信号
• 4.2 泛素化过程
• 5. 泛素-蛋白酶体系统的高度选择性
• 6. 泛素-蛋白酶体系统的生物学功能
• 6.1 泛素-蛋白酶体系统与细胞凋亡
• 6.2 泛素-蛋白酶体系统与细胞周期
• 6.3 膜上受体的泛素化及作用
• 6.4 泛素-蛋白酶体系统与抗原提呈
• 6.5 泛素-蛋白酶体系统在神经系统中的作用
• 6.5.1 泛素-蛋白酶体系统在突触发育中作用
• 6.5.2 泛素-蛋白酶体系统对突触前功能及递质释放的影响
• 6.5.3 泛素-蛋白酶体系统在突触后功能和可塑性中的作用
• 6.6 泛素-蛋白酶体系统与疾病
• 6.6.1 泛素-蛋白酶体系统与肿瘤发生
• 6.6.2 泛素-蛋白酶体系统与神经系统疾病
• 7. 展望
• 8. 参考文献
• （七） 致谢