论文摘要
耐药是临床上化疗失败的主要原因。白血病细胞针对Imatinib的耐药极大地限制了这种具有很好疗效的小分子靶向性药物的临床应用。全面解析其耐药机制是寻求克服耐药提高化疗效果的基础。本研究在人红白血病细胞系K562的基础上,以药物浓度递增的方式长期诱导,建立了对Imatinib耐药倍数达40倍的耐药细胞株,命名为K562/G01。该细胞株对Imatinib诱导的细胞凋亡及细胞毒作用耐受,而对其它MDR类化疗药物如VP16、HHT和非MDR类化疗药物如CDDP均保持敏感。与亲代细胞相比,K562/G01细胞的线粒体数目及嵴部发生明显改变;同时,Bcr/Abl基因拷贝数,mRNA和蛋白水平以及其酪氨酸激酶活性都明显升高,但在Abl酪氨酸激酶ATP结合区并没有点突变发生。这些结果表明Bcr/Abl的活性升高可能是耐药细胞株K562/G01耐药的主要原因。迄今为止研究最为深入和得到最广泛证实的耐药机制是P-糖蛋白（Pgp）过表达机制。然而白血病对Imatinib的耐药是否涉及Pgp,迄今尚无定论。本研究结果表明,Pgp对Imatinib具有一定的外排作用,可使细胞获得2-3倍的耐药性,但并不是Imatinib耐药的主要原因。K562/G01细胞中具有高水平的Pgp表达,但是并不具备药物外排功能。当抑制Bcr/Abl的活性或/加入外源ATP时,K562/G01细胞中的Pgp的活性得到了恢复。表明Bcr/Abl竞争结合ATP所致的细胞内ATP缺乏可能是Pgp功能障碍的主要原因。为了进一步解析肿瘤细胞的耐药机制,寻找与耐药相关的新蛋白靶点,本研究应用了蛋白质组技术,获取了敏感细胞和耐药细胞的蛋白质表达图谱。首先我们比较了敏感细胞K562和Imatinib耐药细胞K562/G01的蛋白质表达图谱,获得了表达差异达2倍及2倍以上的蛋白10个。其中蛋白酶体（proteasome）在K562/G01细胞中表达高出亲代细胞K562约3倍。同时,本研究的结果也阐明了Proteasome可通过IkB的降解从而激活NFkB通路以及调控Bcr/Abl、CyclinB1等蛋白的更新而参与白血病细胞产生对Imatinib的耐药。其次,我们比较了MDR细胞K562/A02和敏感细胞K562的蛋白表达图谱,发现表达水平差异达2倍及2倍以上的蛋白14个。其中Sorcin在MDR K562/A02细胞中的表达水平比亲代细胞高出10倍以上。进一步的研究显示,Sorcin可能通过调节Bcl-2、Bax及Pgp的表达、以及细胞内钙离子的水平参与MDR的发生。综合以上结果可见,Sorcin和Proteasome不仅有望成为诊断耐药和预后的指标,而且有可能成为开发更有效抗耐药肿瘤药物的新靶标。