Caco-2细胞模型作为中药体外“药筛”的方法学研究

论文摘要

目的以Caco-2细胞模型作为复杂成分中药体外药理实验除杂“药筛”，最终建立中药复方体外药理实验的新方法。方法在所建立的Caco-2单层细胞模型上，通过测定跨上皮细胞膜电阻（TEER），比较膜两侧碱性磷酸酶（ALP）活性及几种标准标记物在单层模型的转运特性等指标对Caco-2细胞单层可靠性进行评价；采用药效学方法或HPLC法测定中药提取物灯盏花素及标准品灯盏乙素P（app）值，并对灯盏花素静脉及口服急毒、体外及体内抗氧化作用进行了研究与比对；测定了多种复杂成分中药对Caco-2细胞24h、48h细胞毒及对Caco-2细胞模型TEER值的影响，比较了在AP侧不同pH值条件下受试中药的“药效”P（app）。结果TEER值在细胞单层形成过程中稳定增长，细胞模型两侧培养液中ALP活性差异逐步加大，细胞旁（荧光黄、荧光素）及跨细胞转运（普萘洛尔）标记物均呈现可预见的低或高表观渗透系数(P（app）)值，P-gp标准底物非索非拉定双侧转运流出率（ER）大于2。表明建立的Caco-2细胞模型在完整性、细胞极性、通透性以及P-gp表达等方面均符合胃肠吸收化合物机制研究的要求。两种中药提取物BLC-16和YS经细胞模型转运前后HPLC指纹图谱差异明显。灯盏花素敏感指标“超氧阴离子反应体系”与Caco-2细胞模型转运介质液冲突，最终选定体外总抗氧化能力为指标测定灯盏花素双侧转运“药效“P（app）。同时测定了标准品灯盏乙素双侧转运“成分”P（app）。结果显示，灯盏花素药效P（app）（A-B）为8．03×10（-8）；灯盏乙素“成分”P（app）（A-B）为7．31×10（-8）“药效”与“成分”P（app）十分接近。灯盏花素对小鼠的口服最大耐受剂量（40g／kg）是其静脉急毒LD（50）（1．491g／kg）的约27倍；其体外抗氧化作用突出(如DPPH、超氧阴离子、NO清除能力EC（50）分别为45．6、16．2和10．8μg／ml)，但其体内抗氧化作用不明显。复方丹参滴丸、肉苁蓉总苷、灯盏花素、甘草黄酮、BLC-16及化药奎尼丁对Caco-2细胞24h、48h细胞毒IC（50）值分别为4．6和2mg／ml、873和479μg／ml、256和141μg／ml、29．2和13．7μg／ml、555和163μg／ml、396和373μM；它们对细胞模型紧密连接产生明显影响的临界剂量分别为10mg/ml、6mg/ml、1．5mg/ml、110μg／ml、840μg／ml和120μM。在供侧最佳pH考察中，肉苁蓉总苷、BLC-16适宜在酸性条件下转运，而供侧生理性pH对复方丹参滴丸、甘草黄酮、葛根黄酮转运无明显影响。结论Caco-2细胞模型作为中药复杂成分体外药理实验除杂的“药筛”是可行的。研究者可根据过膜具体中药化学及药理作用特点调整过膜介质、过膜时间、供样浓度及供侧pH值等，以寻求条件的最优化。

论文目录

• 常用英文缩写词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 Caco-2细胞模型的建立与验证
• 1 实验材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4讨论
• 参考文献
• 第二部分 Caco-2细胞模型作为中药复杂成分"药筛"的初步验证——BLC-16、YS经Caco-2细胞转运前后HPLC指纹图谱变化
• 1 受试中药、实验材料和仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第三部分 基于灯盏花素经Caco-2细胞模型转运特征的相关验证
• 第一节 灯盏花素体外药效敏感指标的筛选及灯盏花素与灯盏乙素在敏感指标上的药效比较
• 1 受试中药、实验材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• （app）与灯盏乙素"成分"P_（app）的测定及比较'>第二节 灯盏花素"药效"P_（app）与灯盏乙素"成分"P_（app）的测定及比较
• 1 受试中药、实验材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• （app）反映的生物利用度进行验证的体内药效初步研究'>第三节 对灯盏花素P_（app）反映的生物利用度进行验证的体内药效初步研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四部分 受试中药过膜最佳条件考察
• 第一节 受试中药在细胞模型供侧（AP侧）最佳剂量考察
• 1 受试物、实验材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 第二节 受试中药在细胞模型供侧（AP侧）最适pH值考察
• 1 受试中药及阳性对照药、实验材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 附文献综述
• 附公开发表的学术论文、专著及参加的科研项目