论文摘要
恶性肿瘤的发病率和病死率都呈逐年增加趋势,对人类的健康已造成严重威胁。侵袭与转移是恶性肿瘤共同的生物学特性,也是影响肿瘤患者治疗及预后的重要因素。恶性肿瘤发生侵袭转移是目前肿瘤临床治疗的难点,对其发生机制的探讨是当今国内外学者研究的热点。食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,河南省是高发省份,因此,探讨食管癌浸润、转移的机制具有重要意义。肿瘤发生浸润转移是一个复杂过程,包括肿瘤细胞的粘附、运动、侵袭和血管新生等。S100A4属于钙离子结合蛋白家族成员,是由肿瘤细胞和肿痛活化的间质细胞分泌的活性肿瘤转移调节因子。已被归类为转移相关蛋白。已经证实多种恶性肿瘤存在S100A4高表达。它不仅以非共价同型二聚体的形式存在于细胞内,而且还被分泌出细胞外,以共价二聚体的形式存在于细胞间质而有细胞外作用。存在于细胞间质中的S100A4蛋白是细胞之间信号传导、细胞与细胞基质相互联系、相互作用的基础,也是肿瘤细胞侵袭和转移的病理基础。是一种有很高预后意义的肿瘤转移潜能分子标记物。现认为,S100A4蛋白通过和多种靶蛋白结合发挥细胞内和细胞外作用,可以调节细胞周期的进展,改变细胞的黏附性和运动能力,并增加肿瘤细胞的存活能力,调节肿瘤细胞的侵袭和转移能力。应用RNA干扰或反义寡核苷酸技术抑制S100A4蛋白的表达可使肿瘤细胞的活动能力下降2倍以上。S100A4蛋白尚可影响基质金属蛋白酶（MMPs）及基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）的表达和活性,破坏基底膜的完整性,起到使肿瘤细胞转移的作用。E—钙粘蛋白（E-cadherin）通过维持正常细胞间的黏附力抑制细胞的侵袭,其功能丧失是细胞获得高侵袭性的关键。是公认的肿瘤转移抑制基因。有文献报道在非小细胞性肺癌、宫颈癌等肿瘤中S100A4与E-cadherin呈负相关。使S100A4成为旨在抑制肿瘤转移力的基因治疗的理想选靶目标,为肿瘤的防治提供了一条新的途径。国外已有学者应用免疫组织化学法证实食管鳞癌中存在S100A4过表达,并和食管鳞癌的浸润转移有关,S100A4阳性的患者预后不良。但S100A4在食管鳞癌浸润转移中的分子机制及作用途径尚不清楚。本课题进行了以下研究:1.利用免疫组化技术、Western Blotting及RT-PCR等方法检测S100A4在食管鳞癌组织和食管鳞癌细胞系EC-1、Eca109、EC9706、TE-1中的表达。观察食管鳞癌组织中S100A4表达与MMP-2、E-cadherin的表达的关系及在浸润转移中的作用;采用Boyden侵袭小室检测EC-1、Eca109、EC9706、TE-1 4种食管鳞癌细胞系的体外侵袭力,并分析其与S100A4表达的关系。2.利用RNA干扰技术沉默筛选出来的具有高侵袭性的EC-1细胞中S100A4基因的活性,观察其对EC-1细胞体外侵袭力以及对MMP-2、E-cadherin表达的影响;MTT实验观察S100A4siRNA对食管鳞癌细胞增殖的影响。3.构建裸鼠食管癌移植瘤动物模型,观察移植瘤生长情况。本实验分为以下三部分。第一部分S100A4在食管鳞癌中的表达和MMP-2、E-cadherin表达的相关性及与侵袭潜能的关系方法1.采用免疫组化法对100例食管鳞癌组织及其相应的癌旁正常食管黏膜组织中S100A4、MMP-2及E-cadherin蛋白的表达进行检测。分析S100A4与MMP-2、E-cadherin蛋白表达的关系。2.采用Western Blotting和免疫细胞化学法检测4种食管鳞癌细胞系（EC-1、EC9706、Eca109、TE-1）中S100A4蛋白的表达。采用RT-PCR技术检测4种食管鳞癌细胞系中S100A4 mRNA的表达。3.采用Boyden小室法测定4种食管鳞癌细胞系EC-1、EC9706、Eca109、TE-1的体外侵袭力和运动能力,并分析与S100A4表达的关系。4.统计学处理:利用SPSS11.0软件处理数据,计数资料统计阳性率,采用x2检验（chi-square）;计量资料采用（?）±S表示;两组均数的比较用t检验（t-test）;多组均数的比较用方差分析（ANVOA）;相关性分析采用Pearson′s相关分析法。检验水准取α=0.05。结果1.S100A4在食管鳞癌组织中的表达及与MMP-2及E-cadherin表达的关系以及与临床病理学特征的关系1.1 S100A4蛋白在食管鳞癌组织中的表达S100A4在食管鳞癌细胞中为胞浆着色,食管正常黏膜上皮中胞浆、胞核均着色,食管鳞癌组织中大多数阳性着色细胞散在分布,少数阳性细胞呈灶状分布。间质中可见血管平滑肌细胞、内皮细胞着色;间质淋巴细胞、纤维细胞的胞浆着色较强。在食管鳞癌组织中的阳性表达率为52.00%,明显高于食管正常黏膜上皮中的表达率26.00%,两者相比具有显著性差异（P=0.001）。S100A4蛋白的表达与食管鳞癌的分化程度有关,高、中、低分化鳞癌中S100A4的阳性率分别为36.00%、51.56%、90.91%,差异具有显著性（P=0.040）;S100A4蛋白的表达与食管鳞癌的浸润深度有关,浸润至深层（深肌层和外膜）的阳性表达率（59.38%）明显高于浸润至浅层（黏膜和浅肌层）的阳性率（38.89%）（P=0.049）。S100A4蛋白的表达与食管鳞癌的淋巴结转移有关,在淋巴结转移组S100A4蛋白的阳性表达率（69.50%）高于无淋巴结转移组（40.00%）,差异具有统计学意义（P=0.004）。1.2 MMP-2蛋白在食管鳞癌组织中的表达MMP-2在癌细胞中的阳性表达主要定位于胞浆,部分间质细胞也有表达。MMP-2在食管鳞癌组织中的阳性率（67.00%）明显高于食管正常黏膜上皮的阳性率（31.00%）（P=0.001）。并且与食管鳞癌的分化程度有关（P=0.027）,高、中、低分化鳞癌MMP-2蛋白表达阳性率为48.00%、70.31%、90.91%。MMP-2的表达还与食管鳞癌的浸润转移有关,浸润至深层的食管鳞癌组织中MMP-2蛋白阳性表达率（78.13%）明显高于浸润至浅层的食管鳞癌组织中的阳性表达率（47.22%）,二者相比差异显著（P=0.002）,在淋巴结转移组中MMP-2蛋白的阳性表达率（86.96%）高于无淋巴结转移组（47.00%）（P=0.020）。1.3 E-cadherin蛋白在食管鳞癌组织中的表达E-cadherin在正常黏膜组织主要表现为胞膜的强着色,在癌组织中则胞膜、胞浆均有着色,以胞浆着色为主。E-cadherin在食管鳞癌组织中的表达（44.00%）明显低于食管正常黏膜中的表达（86.00%）（P=0.001）;随癌细胞分化程度的降低E-cadherin蛋白表达也逐渐降低,在高、中、低分化鳞癌中E-cadherin蛋白表达阳性率分别为64.00%、40.63%、18.18%（P=0.026）;随癌细胞浸润深度增加E-cadherin蛋白表达呈降低趋势,但不存在统计学意义,浸润至深层的阳性表达率为39.06%,浸润至浅层的阳性率52.78%（P=0.185）。E-cadherin的表达与淋巴结转移有关,在淋巴结转移组中E-cadherin蛋白的阳性表达率（26.87%）低于无淋巴结转移组（49.35%）,差异具有统计学意义（P=0.049）。1.4 S100A4、MMP-2和E-cadherin蛋白表达的相关性分析食管鳞癌组织中S100A4蛋白表达和MMP-2蛋白表达呈正相关关系（r=0.262,P=0.009）;S100A4蛋白表达和E-cadherin蛋白表达呈负相关关系（r=-0.237,P=0.018）;MMP-2蛋白表达和E-cadherin蛋白表达的相关系数为-0.363（P=0.001）,两者也呈负相关关系。2.S100A4在4种食管鳞癌细胞系（EC-1、Eca109、EC9706、TE-1）中的表达2.1 S100A4蛋白在4种食管鳞癌细胞系中的表达免疫细胞化学结果显示:S100A4蛋白在4株食管鳞癌细胞系EC-1、Eca109、EC9706、TE-1中均有表达,阳性表达主要定位于细胞浆,在Eca109细胞中偶见胞核着色。采用HPIAS-1000高清晰图像处理系统进行图像分析,所测得平均光密度（OD值）为EC-1（0358±0.016）、Eca109（0326±0.025）、EC9706（0.310±0.019）、TE-1（0.285±0.017）,四组相比具有统计学意义（P=0.001）;组间两两比较:Eca109和EC9706之间无统计学意义（P=0.134）,其余各组间均有显著性差异（P＜0.05）。Western Blotting结果表明:在4株食管鳞癌细胞系EC-1、Eca109、EC9706、TE-1中均有S100A4蛋白的表达,在EC-1中表达最高（0.897±0.053）,依次为Eca109（0.806±0.058）、EC9706（0.720±0.068）、TE-1（0.645±0.089）,差异具有统计学意义（P=0.001）,组间两两比较:EC9706和TE-1之间无统计学意义（P=0.073）,其余各组间均有显著性差异（P＜0.05）。2.2 S100A4 mRNA在4种食管鳞癌细胞系中的表达RT-PCR结果显示:S100A4 mRNA在4株食管鳞癌细胞系EC-1、Eca109、EC9706、TE-1中均有目的条带出现,其相对表达量为:EC-1（0.894±0.021）、Eca109（0.890±0.022）、EC9706（0.842±0.028）、TE-1（0.812±0.040）,具有显著性差异（P=0.001）,组间两两比较:EC1和Eca109之间无统计学意义（P=0.723）,其余各组间均有显著性差异（P＜0.05）。3.4种食管鳞癌细胞体外侵袭力和运动能力测定在Boyden侵袭小室实验中,以穿过滤膜的细胞数表示细胞的侵袭力。4种食管鳞癌细胞系中,EC-1过膜细胞数最多（91.00+17.44）,依次Eca109（83.60±12.93）、EC9706（79.00±11.29）、TE-1（61.80±11.10）,4组间差异具有显著性（P=0.001）,组间两两比较:EC-1和Eca109之间无统计学意义（P=0.575）,其余各组间均有显著性差异（P＜0.05）;4种食管鳞癌细胞系的体外运动能力依次为:EC-1（274.28±33.24）、Eca109（251.95±32.71）、EC9706（223.32±56.81）、TE-1（200.12±18.15）,4组数据比较,差异具有显著性（P=0.016）。4.S100A4表达与食管鳞癌细胞体外侵袭力的关系食管鳞癌细胞中S100A4表达与侵袭力的相关性分析显示:S100A4蛋白表达与细胞体外侵袭力的相关系数为0.573（P=0.03）,S100A4mRNA表达与细胞体外侵袭力的相关系数为0.832（P=0.001）。S100A4表达与细胞的侵袭力呈正相关关系,提示细胞的高侵袭性与S100A4的高表达有关。第二部分S100A4siRNA对食管鳞癌细胞体外侵袭力和增殖的影响方法1.将化学合成的50nM的S100A4siRNA用转染试剂转入EC-1细胞,以单纯转染试剂转染的细胞作为对照组。2.RT-PCR及Western Blotting法检测转染S100A4siRNA后0,24,48及72h S100A4 mRNA和蛋白的表达水平。3.Boyden小室法检测转染S100A4 siRNA后0,24,48及72h,对EC-1细胞体外侵袭力及运动能力的影响。4.RT-PCR及Western Blotting法检测转染S100A4siRNA后0,24,48及72h MMP-2和E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平。5.MTT实验检测转染S100A4siRNA后对EC-1细胞增殖的影响。6.统计学处理:利用SPSS11.0软件处理数据,计量资料采用（?）±S表示;两组均数的比较用t检验（t-test）;多组均数的比较用方差分析（ANVOA）;显著性水准为α=0.05。结果1.转染前后细胞生长情况用S100A4siRNA转染食管鳞癌细胞系EC-1后,倒置显微镜下观察发现:转染后细胞融合度变差,细胞中颗粒增多,细胞周围碎片增多,有部分变圆浮起,培养基中出现悬浮细胞。增殖速度明显减慢。未转染细胞贴壁生长,细胞轮廓清楚,细胞间结构紧密,生长旺盛。2.S100A4siRNA有效沉默EC-1细胞中S100A4基因的表达Western Blotting结果表明,S100A4siRNA转染EC-1细胞后,S100A4蛋白的表达量逐渐降低。S100A4/β-actin蛋白半定量结果为:转染0h（0.658±0.017）、24h（0.508±0.010）、48h（0.436±0.008）、72h（0.247±0.006）,统计学分析,转染后24h、48h、72h与各时间点对照组及转染组转染0h相比均有显著性差异（P＜0.05）,且转染后72h抑制效果最佳,S100A4蛋白表达量下降62.46%。RT-PCR显示,转染组S100A4 mRNA半定量结果为:转染0h（0.775±0.014）、24h（0.634±0.006）、48h（0.498±0.008）、72h（0.233±0.012）。经统计分析,转染后24h、48h、72h与各时间点对照组比较均有显著性差异（P＜0.05）;转染组各时间点组间比较均有显著性差异（P＜0.05）,转染72h后S100A4 mRNA的抑制率为69.94%,效果最佳。说明S100A4 siRNA对S100A4表达的抑制作用具有高度特异性和时间依赖性。3.S100A4siRNA抑制食管鳞癌细胞体外侵袭力和运动能力EC-1细胞转染S100A4siRNA 48h后,细胞的体外侵袭力和运动力明显下降,且随转染时间延长下降更加突出,转染72h细胞体外侵袭力下降60.66%,体外侵袭力:转染0h（85.46±15.10）、24h（76.86±18.64）、48h（59.39±7.47）、72h（33.62±7.82）（P＜0.05）;转染72h细胞体外运动力下降60.80%,体外运动能力:转染0h（270.33±27.11）、24h（264.55±34.24）、48h（163.13±34.15）、72h（105.96±6.64）（P＜0.05）。4.S100A4siRNA抑制EC-1细胞中MMP-2的表达RT-PCR及Western Blotting结果表明,EC-1细胞转染S100A4siRNA后,MMP-2蛋白和MMP-2 mRNA的表达水平逐渐降低。MMP-2/β-actin mRNA半定量结果为:转染0h（1.004±0.058）、24h（0.969±0.077）、48h（0.622±0.035）、72h（0.275±0.078）。转染后48h、72h与相应对照组相比有明显差异（P＜0.05）;MMP-2/β-actin蛋白半定量结果为:转染0h（0.864±0.054）、24h（0.710±0.041）、48h（0.549±0.041）、72h（0.288±0.050）。转染后24h、48h、72h与相应对照组相比,均有统计学意义（P＜0.05）。由此可见,S100A 4siRNA下调MMP-2蛋白的表达出现相对较早,表明S100A4除影响MMP-2 mRNA转录活性外,也可能对MMP-2 mRNA转录后蛋白合成有直接调节作用。5.S100A4 siRNA对E-cadherin表达的影响EC-1细胞转染S100A4siRNA后,RT-PCR及Western Blotting结果表明:E-cadherin蛋白和mRNA的表达水平逐渐增强。转染0h与24h无明显变化,转染后48h、72h与对照组相比均有显著性差异（P＜0.05）。E-cadherin/β-actin mRNA半定量结果为:转染后0h（0.318±0.013）、24h（0.334±0.023）、48h（0.476±0.022）、72h（0.586±0.013）;E-cadherin/β-actin蛋白半定量结果为:转染后0h（0.289±0.012）、24h（0.294±0.020）、48h（0.479±0.014）、72h（0.625±0.022）。6.S100A4 siRNA体外抑制食管鳞癌细胞增殖MTT结果显示,转染S100A4 siRNA后细胞增殖能力明显受到抑制,转染后48h,转染组和对照组的吸光度值分别为（0.487±0.019）、（0.571±0.019）（P＜0.05）;转染后72h,转染组和对照组的吸光度值分别为（0.488±0.008）、（0.681±0.013）（P＜0.05）。转染后48h和72h对细胞生长的抑制率分别为14.71%、28.34%,说明S100A4 siRNA有抑制食管鳞癌细胞增殖的作用。第三部分S100A4siRNA对裸鼠体内食管癌移植瘤生长及基因表达的影响方法1.裸鼠食管癌异种移植瘤动物模型的建立:取对数生长期EC-1细胞,调整细胞浓度为（1×107/ml）,在每只裸鼠前肢右腋背部皮下接种0.2ml,构建裸鼠移植瘤模型。2.将成功构建的食管癌裸鼠异种移植瘤动物模型随机分成3组:S100A4siRNA组（A）、阴性对照siRNA（B）、空白对照组（C）。每组5只。分别给予50nM S100A4siRNA、50nM无关序列siRNA和PBS,每只200μl瘤旁注射,隔日治疗1次,共14次。3.每日观察裸鼠肿瘤体积变化（采用游标卡尺进行测量）,绘制肿瘤生长曲线。实验结束时统一处死小鼠,称取瘤重。计算肿瘤抑制率,公式为:肿瘤抑制率=（对照组瘤体重量-实验组瘤体重量）/对照组瘤体重量×100%。4.各组裸鼠肿瘤组织进行常规病理切片及HE染色;免疫组化SP法检测上述各组瘤体组织中S100A4、MMP-2和E-cadherin蛋白的表达情况。5.RT-PCR检测各组瘤体组织中S100A4、MMP-2和E-cadherin mRNA的表达情况。6.统计学处理:利用SPSS11.0软件处理数据,资料采用（?）±S表示;两组均数的比较用t检验（t-test）;多组均数的比较用方差分析（ANVOA）。以α=0.05为显著性水准。结果1.15只裸鼠皮下全部成瘤,EC-1细胞株异种移植致瘤率为100%,成瘤时间均在接种后1周左右。2.不同方法处理后各组裸鼠肿瘤体积和瘤体重量的比较各组裸鼠治疗前肿瘤体积经统计学分析无显著性差异。不同方法处理后,A组肿瘤体积（997.74±82.54mm3）与B组（1405.10±182.71mm3）和C组（1459.75±138.43mm3）相比明显较小,具有统计学差异（P＜0.05）,B组与C组肿瘤体积无明显差异（P＞0.05）。处死动物后,分离肿瘤并称重。A组移植瘤重量较轻（0.493±0.021g）,和B组（0.680±0.031g）、C组（0.701±0.046g）相比差异均有显著性意义（P＜0.01）。B组与C组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。3.不同方法处理后对食管癌异种移植瘤细胞形态的影响光镜下观察发现,A组肿瘤细胞体积较小,核染色质稀疏,少见痛巨细胞,瘤组织间可见点、片状坏死灶。B组和C组肿瘤细胞大小不一,核染色质多,核大不规则,瘤巨细胞常见,异型性明显。4.不同方法处理后食管癌异种移植瘤中S100A4、MMP-2和E-cadherin蛋白的表达免疫组化结果以随机计数5个高倍视野,每视野记录200个细胞内阳性细胞数的平均数表示,S100A4蛋白在抑制瘤中的表达量为:A组（68±4）、B组（123±14）、C组（135±18）,S100A4蛋白在A组瘤体内的表达低于在B组和C组的表达（P＜0.05）,B组和C组相比无明显统计学差异（P＞0.05）,说明瘤旁注射S100A4siRNA可以有效抑制移植瘤内S100A4蛋白的表达;MMP-2蛋白在A组瘤体内的表达（76±8）低于B组（134±9）和C组（142±7）。E-cadherin蛋白在A组瘤体内的表达（68±6）均高于在B组（41±2）和C组（36±4）的表达（P＜0.05）。与体外实验结果相一致。5.3组食管癌异种移植瘤中S100A4、MMP-2和E-cadherin mRNA的表达RT-PCR半定量结果显示:S100A4 mRNA在三组中的表达量分别为:A组（0.334±0.027）、B组（0.689±0.035）、C组（0.702±0.047）;MMP-2 mRNA表达量为:A组（0.572±0.084）、B组（0.804±0.173）和C组（0.922±0.451）。S100A4和MMP-2mRNA在A组瘤体内的表达均低于在B组和C组的表达（P＜0.05）,B组和C组相比无明显统计学差异（P＞0.05）。E-cadherin mRNA在A组瘤体内的表达（0.516±0.274）均高于在B组（0.327±0.033）和C组（0.284±0.057）的表达（P＜0.05）。结论1.食管鳞癌组织及食管鳞癌细胞系中S100A4高表达并与食管鳞癌的浸润转移有关。2.体外实验提示,4种食管鳞癌细胞系中EC—1细胞具有高侵袭性。食管鳞癌细胞的高侵袭性与S100A4的高表达有关。3.S100A4siRNA能有效地阻断食管鳞癌细胞中S100A4的表达,并对细胞的侵袭力及运动能力具有抑制作用。4.S100A4与MMP—2的正相关关系及与E-cadherin的负相关关系,表明S100A4对食管鳞癌浸润转移力的影响与MMP—2及E-cadherin具有协同作用;S100A4 siRNA沉默S100A4活性可导致MMP—2的表达受到抑制,而E-cadherin的表达增加,提示S100A4可能对MMP—2及E-cadherin基因存在某种调节机制。5.S100A4 siRNA具有抑制食管鳞癌细胞增殖的能力。6.裸鼠移植瘤模型体内研究显示,S100A4siRNA能有效降低移植瘤中S100A4的表达,抑制裸鼠移植瘤生长,表明靶向S100A4的RNA干扰技术有可能成为食管癌基因治疗的新策略。