铜绿微囊藻及微囊藻毒素对克氏原螯虾的毒性作用

论文摘要

铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）是蓝藻水华中最常见的一种藻类,经常于高温季节在淡水湖泊或池塘中爆发,对水产养殖造成重大危害。其产生的微囊藻毒素（Microcystin, MCs）是一种环七肽肝毒素,能造成肝脏肿胀淤血、肝体比重增加及一系列的酶学变化,超微结构显示肝细胞骨架破坏,肝脏出血坏死。大量研究表明MCs具有稳定性,不但能够在生物链中积累,而且能够诱导细胞凋亡,造成氧化应激反应,甚至可直接损伤遗传物质DNA。目前已经证实饮用水中MCs的存在与人群中的原发性肝癌和大肠癌的发病率有很大的相关性,以成为致我国南方肝癌高发的三大环境危险因子之一。铜绿微囊藻及微囊藻毒素已经对水生经济动物甚至人类的健康造成了严重危害。克氏原螯虾作为重要的水产经济动物,由于其长期生活在河沟、池塘、农田等蓝藻水华易发地,近几年也是研究重点。克氏原螯虾因其肉味鲜美、营养丰富,深受广大消费者喜爱。蓝藻水华时微囊藻毒素可在克氏原螯虾肝胰腺中富集,但通常去头胸甲后食用。对于蓝藻水华是否能通过克氏原螯虾这一食物链中介传递,并对人类健康造成严重危害有待于进一步研究。本文就目前国内外研究现状,对MCs引起的毒理学效应（包括肝、肾毒性,诱导细胞凋亡,调控相关基因的转录,影响相关蛋白的表达及免疫系统的影响）进行了综述,并探讨了铜绿微囊藻及微囊藻毒素对克氏原螯虾的毒性作用。将克氏原螯虾幼体置于含不同浓度的铜绿微囊藻水体中,记录幼虾在铜绿微囊藻水体中的存活情况并观察幼虾外部形态的变化,取幼虾肝胰腺经透射电镜观察超微结构的变化。设置不同梯度的铜绿微囊藻,将成虾暴露其中,采样THC的方法,观察血淋巴总数的变化,探索铜绿微囊藻对克氏原螯虾血淋巴细胞数量产生的影响;通过研究几种应激反应相关酶类的变化,分析铜绿微囊藻对克氏原螯虾的应激效应。同时采用一种鉴定血细胞吞噬能力的新方法,即构建表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌作为吞噬源,用不同浓度的微囊藻毒素作用于in vitro培养的克氏原螯虾原代血淋巴细胞后,比较正常血淋巴细胞和微囊藻毒素作用的血淋巴细胞的吞噬能力差异,研究微囊藻毒素作用后离体条件下克氏原螯虾血淋巴细胞损伤及免疫能力的变化。通过以上不同的技术路线来探讨铜绿微囊藻及微囊藻毒素对克氏原螯虾的慢性毒理机制。研究结果如下:（1）铜绿微囊藻显著降低了幼虾的存活率:当藻细胞浓度为5.0×106 cells/ml时,暴露26天后幼虾存活率显著低于对照组（p<0.05）,为68.33%;浓度达1.0×107 cells/ml时,19天存活率下降至61.67%,显著低于对照组（p<0.05）,30天后,存活率不足50%,仅48.33%。（2）显微观察发现:当置于1.0×107 cells/ml及以上浓度浓度的铜绿微囊藻液中培养7天后,幼虾肝胰腺呈现暗红色,并伴有一定的肿大现象,透射电镜显示其肝胰腺细胞受到损伤。（3）高浓度的铜绿微囊藻能造成克氏原螯虾的应激反应:总血细胞密度（THCs）在不同浓度暴露铜绿微囊藻1d后显著升高,之后一直稳定在较高水平于对照组存在显著性;血清中血蓝蛋白在铜绿微囊藻暴露后其含量变化不明显,只在第5天时1.0×107 cells/ml组显著低于对照组（p<0.05）;血清中的T-SOD活力在1d后受到抑制,5d时被激活至较高水平;POD和PO活性都表现出先显著性增强（p<0.01）回落后又有所增加的波动趋势;鳃丝中Na+/K+-ATP酶活性在暴露后1d显著降低（p<0.01）后回升,并最终维持在较高水平。（4）比较微囊藻毒素作用后血淋巴细胞的吞噬能力的变化发现,微囊藻毒素-LR能显著抑制血淋巴细胞吞噬指数,并与微囊藻毒素存在一定的剂量效应,而吞噬百分比在毒素暴露前后没有显著性变化。以上结果表明,铜绿微囊藻对克氏原螯虾幼虾的存活及成虾免疫力有一定的影响:幼虾存活率显著降低,外部形态及肝胰腺超微结构有显著变化;而成虾酶活力的变化最终趋向于初始值或维持在一定范围,对克氏原螯虾成虾免疫力存在影响,但都在其免疫耐受范围内。而微囊藻毒素作为一种肝毒素,同样对离体条件下克氏原螯虾血淋巴细胞的免疫能力有一定的影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 前言
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 克氏原螯虾
• 1.2.2 铜绿微囊藻
• 1.2.3 微囊藻毒素
• 1.2.3.1 微囊藻毒素的一般结构
• 1.2.3.2 微囊藻毒素的理化性质
• 1.2.3.3 MCs 的毒理学作用研究现状
• 1.3 论文需要解决的问题
• 1.4 论文的实用价值和理论意义
• 第二章 铜绿微囊藻对克氏原螯虾幼虾的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 铜绿微囊藻对克氏原螯虾幼虾存活率的影响
• 2.1.2.2 铜绿微囊藻暴露后对幼体进行外部结构观察
• 2.1.2.3 铜绿微囊藻对克氏原螯虾幼虾肝胰腺超微结构的影响
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同浓度的铜绿微囊藻对克氏原螯虾幼虾存活率的影响
• 2.2.2 铜绿微囊藻对克氏原螯虾幼体外部形态的影响
• 2.2.3 铜绿微囊藻对克氏原螯虾幼体肝胰腺超微结构的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 铜绿微囊藻对克氏原螯虾成虾应激相关酶类的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 铜绿微囊藻对总血细胞密度（THCs）的影响
• 3.2.2 铜绿微囊藻对克氏原螯虾血蓝蛋白及 PO 的影响
• 3.2.3 铜绿微囊藻对克氏原螯虾血清中T-SOD 及POD 的影响
• +/K⁺-ATP 酶活性的影响'>3.2.4 铜绿微囊藻对克氏原螯虾鳃丝中 Na⁺/K⁺-ATP 酶活性的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 微囊藻毒素对离体培养克氏原螯虾血淋巴细胞吞噬能力的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 构建表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌
• 4.1.2 克氏原螯虾血淋巴细胞离体培养
• 4.1.3 克氏原螯虾血淋巴细胞吞噬情况观察
• 4.1.4 微囊藻毒素对克氏原螯虾虾血淋巴细胞吞噬能力的影响
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 验证能表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌
• 4.2.2 克氏原螯虾血淋巴细胞吞噬情况观察
• 4.2.3 微囊藻毒素对克氏原螯虾虾血淋巴细胞吞噬能力的影响
• 4.3 讨论
• 第五章：结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录 1 BG-11 营养液配方
• 附录 2 B 型小量质粒快速提取试剂盒使用说明
• 附录 3 克氏原螯虾实验室养殖过程中存在的问题
• 发表的论文及学术会议
• 致谢