挪威鼠Hspa4基因的克隆及遗传转化水稻抗逆性的研究

论文摘要

热激蛋白（Heat Shock Proteins,HSP）又称热休克蛋白或应激蛋白（Heat Stress Proteins）,是一组在进化上高度保守的、原核和真核生物中普遍存在的蛋白质。在热激、冷激、有机物、重金属、缺氧以及基因损伤、组织创伤、微生物感染等应激条件下,生物体内大部分正常蛋白质的合成和mRNA的转录被抑制,同时迅速合成一些逆境蛋白能够抵御不良环境。挪威鼠热激蛋白（Rattus norvegicus heat shock protein 4,Hspa4）,又称为irp94（ischemia responsive 94 kDa protein）,通过参与热激响应、未折叠蛋白应答等来保护机体免受损伤,在正常生理条件下参与依赖ATP的蛋白质运输,折叠和装配过程;Hspa4（HSP70）是哺乳动物细胞内很重要的一种移动性较大的分子伴侣,具有阻止蛋白质变性的功能,热激或其它胁迫下可能参与体内变性蛋白质的清除,以防止其凝聚,损伤细胞。本文通RT-PCR技术克隆了Hspa4基因,构建了超表达载体和诱导表达载体,将其转化水稻愈伤组织,用潮霉素抗性基因筛选出株转基因植株并进行检测。为通过基因工程改良植物抗逆性提供了材料和理论基础,并为提高作物产量提供了依据。取得了如下进展:①Hspa4基因的克隆采用RT-PCR技术克隆了Hspa4基因的全长cDNA长度2530 bp,该序列包含2523bp阅读框,编码840个氨基酸,与GenBank中Hspa4序列比对,核苷酸序列同源性为99.96%,只有一个碱基发生突变,1682bp处的碱基T突变为C,导致该位点处氨基酸由Met变为Thr,氨基酸序列分析结果显示在该位置处氨基酸Thr和Met几乎各占一半,小家鼠在该位置处为Thr,推测Hspa4在该氨基酸位点处最大的可能性应为Thr。而且立体结构分析显示,克隆的序列与原序列立体结构完全一致。②高等植物启动子的克隆利用PCR方法共克隆了3个植物启动子,其中组成型的启动子有两个包括玉米泛素Ubi-1启动子和水稻激动蛋白Actin启动子（Genbank登录号:EU155408）,GUS组织染色法表明这两个启动子都具有瞬时检测活性,其转化效率远远高于CaMV 35S启动子,该启动子为超量表达目的基因提供了基础.。本实验还克隆了拟南芥耐高盐、耐低温、耐干旱Rd29A启动子,该启动子可在高盐、低温、干旱的诱导下大量表达目的基因,可提高作物的抗性。③植物表达载体的构建本实验构建了6个植物表达载体,其中3个含有启动子驱动GUS基因的植物表达载体pBI121-Ubi-GUS、pCAMBIA1301-Actin-GUS、pCAMBIA1301-Rd29A -GUS,为研究启动子的功能打下了基础;成功构建了分别由2个启动子分别驱动的Hspa4基因的植物表达载体pCAMBIA1301-Ubi-Hspa4、pBI121-Hyg-Ubi-Hspa4 pCAMBIA1301-Rd29A-Hspa4,为通过基因工程提高水稻的抗性提供了材料。④转基因植株的获得及检测通过农杆菌介导法将6个植物表达载体转化进水稻基因组中,共获得了近百株转基因植株,有66株已通过PCR检测,其中阳性转基因植株有27棵。转基因植株的获得为筛选抗逆性水稻品种提供了材料和依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 热激蛋白研究进展
• 1.2.1 热激蛋白研究简史
• 1.2.2 热休克蛋白的分类和定位
• 1.2.3 热激反应的特点
• 1.2.4 热激蛋白的功能
• 1.2.5 热激蛋白基因的表达调控
• 1.2.6 热体克蛋白的检测方法
• 1.2.7 HSP100 家族耐热性研究
• 1.2.8 高等植物中的HSP100 家族及其相关基因的克隆
• 1.3 高等植物启动子研究进展
• 1.3.1 启动子类型和应用研究
• 1.3.2 克隆植物启动子的方法
• 1.3.3 启动子功能和结构研究的策略
• 1.3.4 问题与展望
• 1.4 本文研究的目的和研究内容
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.3 技术路线
• 1.4.4 本实验创新点
• 2 挪威鼠 Hspa4 基因的克隆
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 挪威鼠总RNA 提取
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.3 挪威鼠Hspa4 基因RT-PCR 扩增
• 2.2.4 PCR 产物回收
• 2.2.5 连接转化
• 2.2.6 质粒提取
• 2.2.7 质粒检测
• 2.2.8 全长基因获得
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 RNA 的提取
• 2.3.2 质粒提取及检测
• 2.3.3 全长基因获得
• 2.3.4 基因测序结果
• 2.4 小结
• 3 植物启动子基因的克隆
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 DNA 提取试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 PCR 引物
• 3.2.2 组成型启动子的克隆
• 3.2.3 诱导型启动子的克隆
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 水稻肌动蛋白Actin 启动子的克隆
• 3.3.2 玉米泛素Ubi-1 启动子的克隆
• 3.3.3 拟南芥Rd29A 启动子的克隆
• 3.4 小结
• 4 潮霉素抗性基因的克隆
• 4.1 材料
• 4.1.1 模版材料
• 4.1.2 引物设计
• 4.2 潮霉素抗性 Hyg 基因的克隆
• 4.3 结果与分析
• 4.4 小结
• 5 挪威鼠 Hspa4 植物表达载体的构建与鉴定
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.2.1 植物表达载体pCAMBIA1301-Act2-GUS 的构建
• 5.2.2 植物表达载体pBI121-Ubi-GUS 的构建
• 5.2.3 植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-GUS 的构建
• 5.2.4 植物表达载体pCAMBIA1301-Ubi-Hspa4 构建
• 5.2.5 植物表达载体pBI121-Ubi-Hyg-Hspa4 的构建
• 5.2.6 植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-Hspa4 的构建
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 植物表达载体pCAMBIA1301-Act2-GUS 的鉴定
• 5.3.2 植物表达载体pBI121-Ubi-GUS 的鉴定
• 5.3.3 植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-GUS 的鉴定
• 5.3.4 植物表达载体pCAMBIA1301-Ubi-Hspa4 的鉴定
• 5.3.5 植物表达载体 pBI121-Ubi-Hyg-Hspa4 的鉴定
• 5.3.6 植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-Hspa4 的鉴定
• 5.4 小结
• 6 挪威鼠 Hspa4 基因转化水稻
• 6.1 材料
• 6.1.1 菌种和质粒
• 6.1.2 生物材料
• 6.1.3 培养基
• 6.2 方法
• 6.2.1 植物表达载体转化农杆菌
• 6.2.2 重组农杆菌PCR 鉴定
• 6.2.3 根癌农杆菌转化水稻愈伤
• 6.2.4 GUS 组织化学染色检测
• 6.2.5 转基因植株的获得
• 6.2.6 转基因植株的PCR 检测
• 6.3 结果和分析
• 6.3.1 水稻胚性愈伤组织的诱导
• 6.3.2 预培养和共培养
• 6.3.3 筛选抗性愈伤
• 6.3.4 GUS 组织化学染色
• 6.3.5 转基因植株的获得
• 6.3.6 转基因植株的检测
• 6.4 小结
• 6.4.1 筛选标记的选择
• 6.4.2 乙酰丁香酮的使用
• 6.4.3 农杆菌检测
• 6.4.4 水稻品种的选择
• 6.4.5 受体材料的选择
• 6.4.6 培养基的选择
• 6.4.7 共培养时间
• 7 结论与展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 试剂配方
• B. 细菌培养基配方
• C. 植物培养基配
• D 作者在攻读学位期间发表的论文目录
• E 作者在攻读学位期间在GENBANK 中登陆的序列号