猪背最长肌差异表达基因的克隆鉴定及其特征分析

论文题目: 猪背最长肌差异表达基因的克隆鉴定及其特征分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 徐德全

导师: 熊远著

关键词: 背最长肌,抑制消减杂交,表达,克隆

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 骨骼肌是动物体内最丰富的组织,占肉用动物体重的45%～60%,其生长发育是肉用家畜最重要的性状之一。不同猪种由于来源、长期所处的地理环境以及所接受的饲养方式和选育性状重点的不同,从而形成了各自的种质特性,使其在肌肉相关性状方面存在较大的差异。两个具有不同性状的亲本杂交产生的杂种在肌肉生长、肌肉品质等方面也往往超过其双亲,产生杂种优势的现象。随着人们对基因结构和功能的研究深入,人们已经认识到这些差异及杂种优势现象应是基因差异表达的结果。所以本研究以猪背最长肌为材料,利用抑制消减杂交技术构建了不同猪种（长白与梅山）以及猪杂交亲代与子代（大白与长大）背最长肌间的正反向消减cDNA文库,进行了差异表达基因的筛选、克隆和鉴定,取得了如下结果: 1.以管家基因G3PDH作为消减指标,对每个消减文库的消减效率进行了检测,结果表明4个消减文库的消减效率都达25倍以上,有的甚至高达210倍,这同时也表明了某些特异于两种肌肉组织的差异表达基因的富集效率也达25倍以上,说明所构建的消减cDNA文库质量很好。 2.从以梅山猪为Tester、长白猪为Driver和以杂交母本大白猪为Tester、杂种F1长大猪为Driver的消减cDNA文库中我们分别随机挑取了800多个克隆。利用PCR技术进行鉴定,分别获得了759和773个有效阳性克隆,插入片段长度主要分布于150～750bp之间。 3.利用正向消减cDNA、反向未消减cDNA、反向消减cDNA作探针对两消减cDNA文库中的阳性克隆进行了高通量筛选。在以梅山猪为Tester、长白猪为Driver的消减cDNA文库中,我们选取了27个差异表达克隆进行分析,发现共代表14个ESTs,4个在猪中为已知基因,10个在猪中为未知基因,其中7个与人等其他物种的基因有高同源性,3个未找到明显的同源性。在以杂交母本大白猪为Tester、杂种F1长大猪为Driver的消减cDNA文库中,我们选取了24个差异克隆进行分析,发现共代表12个ESTs,5个在猪中为已知基因,7个在猪中为未知基因,但分别与人等其他物种的基因有高的同源性。并利用含内标化的半定量RT-PCR技术进行了验证,结果表明大部分为差异表达。 4.将电脑克隆和SMART技术相结合,成功克隆了7个差异表达全长基因:（1）CCNG1,GenBank登录号为AY974246,cDNA全长2359bp,ORF为888bp;（2）EEF1A,cDNA全长1777bp,ORF为1389bp;（3） ETFB-like,cDNA全长898bp,ORF为765bp;（4） HUMMLC2B,GenBank登录号为AY754870,cDNA全长681bp,ORF为510 bp;（5） PGK1,GenBank登录号为AY677198,cDNA全长1789bp,ORF为1254bp;（6） TXNIP,cDNA全长1880 bp,ORF为1176 bp;（7） CKM,

论文目录:

中文摘要

英文摘要

缩略语表

大梅F2测定性状的英文缩写

第一章 前言

1 不同猪种生长、胴体、肉质等性状的差异及研究现状

1.1 不同猪种在生长、胴体、肉质等性状上的差异

1.2 不同猪种生长、胴体、肉质等性状差异原因的研究进展

1.2.1 影响不同猪种生长、胴体、肉质等性状差异的非遗传因素

1.2.2 影响不同猪种生长、胴体、肉质等性状差异的遗传因素

1.2.2.1 影响不同猪种生长性状的主基因和候选基因

1.2.2.2 影响不同猪种胴体性状的主基因和候选基因

1.2.2.3 影响不同猪种肉质性状的主基因和候选基因

1.2.2.4 影响不同猪种繁殖性状的主基因和候选基因

1.2.2.5 影响不同猪种抗病性状的主基因和候选基因

2 猪基因差异表达的研究进展

2.1 基因差异表达研究方法

2.1.1 消减杂交法(Subtractive Hybridization)

2.1.2 mRNA差异显示技术(mRNA Differential Display)

2.1.3 代表性序列差别分析(Representational Difference Analysis)

2.1.4 抑制消减杂交法(Suppression Subtractive Hybridization)

2.1.5 基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression)

2.1.6 基因鉴定集成法(Integrated Procedure for Gene Identification)

2.1.7 cDNA微阵列(cDNA microarray)

2.2 猪基因差异表达的研究现状

3 研究目的和意义

第二章 材料与方法

1 主要仪器设备

2 试剂盒、试剂和酶、载体及菌株

2.1 试剂盒

2.2 试剂和酶

2.3 载体和菌株

3 实验样品

3.1 组织样

3.2 猪群和DNA样

4 实验方法

4.1 背最长肌总RNA的制备

4.2 背最长肌mRNA的分离

4.3 SMART cDNA的合成

4.4 抑制消减杂交

4.4.1 Driver和Tester cDNA的制备

4.4.2 Tester cDNA的接头连接效率检测

4.4.3 消减杂交

4.4.4 PCR扩增

4.4.5 消减效率检测

4.5 消减cDNA文库的构建

4.5.1 连接

4.5.2 细菌转化

4.6 消减cDNA文库的筛选

4.6.1 PCR筛选

4.6.2 斑点杂交筛选

4.6.2.1 探针制备

4.6.2.2 斑点杂交

4.7 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析

4.8 RT-PCR检验基因差异表达

4.8.1 背最长肌总RNA的制备

4.8.2 RT-PCR反应

4.9 差异基因全长克隆及序列分析

4.9.1 电子延伸

4.9.2 RACE-PCR

4.9.3 RACE-PCR产物的回收与纯化

4.9.4 克隆与测序

4.9.5 计算机分析

4.10 差异基因表达分析

4.10.1 总RNA的制备

4.10.2 RT-PCR反应

4.11 差异基因的基因组结构分析、序列克隆

4.12 多态性分析和SNP研究

第三章 结果与分析

1 背最长肌总RNA的提取

2 背最长肌mRNA的分离纯化

3 SMART cDNA的合成

4 抑制消减杂交

4.1 Driver和Tester cDNA的制备

4.2 消减杂交、抑制性PCR和消减效率检测

5 消减cDNA文库的构建和筛选

5.1 消减cDNA文库的构建和PCR筛选

5.2 斑点杂交筛选

6 阳性克隆测序及序列分析

7 基因差异表达的RT-PCR验证

8 差异基因全长克隆及序列分析

8.1 MS60(CCNG1:cyclin G1)

8.2 MS46(EEF1A:eukaryotic translation elongation factor 1 alpha)

8.3 MS81(ETFB-like:Electron transfer flavoprotein,beta polypeptide-like)

8.4 DB245(HUMMLC2B:skeletal muscle myosin regulatory light chain 2B)

8.5 DB47(PGK1:phosphoglycerate kinase 1)

8.6 DB189(TXNIP:thioredoxin interacting protein)

8.7 DB226(CKM:muscle creatine kinase)

9 差异基因表达分析

9.1 差异基因的不同品种间表达分析

9.2 差异基因的不同发育阶段表达分析

9.3 差异基因的不同组织表达分析

10 差异基因的基因组结构分析、序列克隆和多态性分析

10.1 MS60(CCNG1:cyclin G1)

10.2 DB245(HUMMLC2B:skeletal muscle myosin regulatory light chain 2B)

10.3 DB189(TXNIP:thioredoxin interacting protein)

10.4 DB47(PGK1:phosphoglycerate kinase 1)

10.5 DB37 (KIAA1717:H3-K4-specific methyltransferase)

11 SNPs研究

11.1 MS60-2-Nco Ⅰ-RFLP

11.2 MS60-345-1-TspE Ⅰ-RFLP

11.3 DB245-2-Msp Ⅰ-RFLP

11.4 DB37-Msp Ⅰ-RFLP

第四章 讨论

1 关于抑制消减杂交技术

2 关于高通量筛选

3 关于含内标化的半定量RT-PCR

4 关于EST的电脑克隆和RACE

5 关于PCR引物设计及优化

6 关于猪与人、鼠间基因结构和编码区序列的保守性

7 关于差异表达基因

7.1 基因Cyclin G1(MS60)

7.2 基因EEF1A(MS46)

7.3 基因ETFB-like(MS81)

7.4 基因HUMMLC2B(DB245)

7.5 基因PGK1(DB47)

7.6 基因TXNIP(DB189)

7.7 基因CKM(DB226)

8 关于差异表达基因的SNPs

9 关于SNPs的遗传效应

9.1 MS60-2-NcoⅠ-RFLP和MS60-345-1-rspEⅠ-RFLP

9.2 DB245-2-MspⅠ-RFLP

9.3 DB37-MspⅠ-RFLP

10 关于下一步工作

小结

参考文献

附录一

用于表达分析的引物

用于基因克隆的引物

附录二

攻读博士学位期间发表和已投稿的论文

致谢

发布时间: 2005-12-05

参考文献

• [1].猪背最长肌肌内脂肪含量相关基因的筛选及表达分析[D]. 王昱丁.山东农业大学2017
• [2].宁夏黑猪背最长肌常规营养成分含量、组织学特性和肉质特性研究[D]. 刘顺德.甘肃农业大学2006
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• [4].猪IGF-Ⅱ基因变异对猪生长性状及肌肉发育相关基因表达的影响[D]. 虞德兵.南京农业大学2007
• [5].营养胁迫条件下牦牛皮下脂肪和背肌差异microRNAs的筛选与鉴定[D]. 褚敏.中国农业科学院2015
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• [8].不同品种/品系/类群牛背最长肌的比较蛋白质组学分析[D]. 郝瑞杰.西北农林科技大学2015
• [9].草原红牛初生公牛与成年公牛背最长肌基因表达差异分析[D]. 秦立红.吉林大学2010
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