化学性肝损伤及肝癌的代谢组学研究

论文摘要

肝脏是机体最重要的代谢器官之一,而化学性肝损伤是引发多种肝脏疾病的重要始动环节。因此,针对化学性肝损伤的发病机制以及药物干预效应的研究,对慢性肝病的防治具有十分重要的意义。动物实验是研究化学诱导急性肝损伤发病机制的必经之路,在研究肝脏疾病发病机制及抗肝脏疾病药物的过程中,选择有科学性、实用性、重现性的肝损伤动物模型的意义亦十分重要。在肝损伤的实验研究中,四氯化碳（CCl4）诱导的化学性肝损伤和酒精性肝损伤模型是比较常见的两种动物模型。本课题将利用建立的代谢组学方法,分别对两种肝损伤模型动物的代谢特征开展研究,并利用代谢组学方法对药物干预效应进行评价。同时,在动物模型研究的基础上,本课题进一步尝试利用代谢组学方法,对临床原发性肝癌（PLC）患者的代谢特征进行分析,探索将代谢组学方法应用于临床疾病机制研究的新思路。本课题首先建立了基于色谱质谱联用技术的肝组织的代谢组学研究方法。在此基础上,重点考察了CCl4及酒精诱导的急性肝损伤大鼠尿液及肝组织的代谢谱变化,并从代谢水平观察甘利欣对CCl4诱导化学性肝损伤的保护作用及其机制。同时,在整体代谢水平上分析了临床肝癌病人与正常对照人群的代谢谱差异。本课题的主要内容和结果如下:1.建立了基于氯甲酸乙酯衍生化（ECF）的气相色谱质谱联用（GC/MS）分析以及基于三甲基硅烷（TMS）衍生的气相色谱飞行时间质谱（GC/TOFMS）分析的肝组织代谢组学研究方法。针对前者的分析特点,采用高氯酸乙醇两步提取法提取肝组织中的小分子内源性代谢物,后者采用氯仿/甲醇/水的混合溶剂进行两步提取。两种分析方法均经方法学验证表明重复性好、灵敏度高、精密度高,适用于肝组织的快速、高通量检测。2.采用ECF衍生、GC/MS分析的代谢组学研究方法,尝试着从整体代谢水平上考察大鼠在CCl4诱导急性肝损伤过程中尿液及肝组织中内源性小分子代谢物谱的变化,并观察甘利欣预防性给药对CCl4诱导急性肝损伤的保护作用。结合多维统计方法,发现肝损伤大鼠尿液和肝组织样本中小分子内源性代谢物发生了明显变化,并找到使得正常组和模型组区分开的相关差异性代谢物,且尿液和肝组织样本代谢谱所提供的信息相互补充,经初步分析CCl4诱导的急性肝损伤与三羧酸循环、部分氨基酸代谢等高度相关。3.以酒精诱导的大鼠急性肝损伤模型为研究对象,采用ECF衍生、GC/MS分析的代谢组学研究方法检测了大鼠尿液及肝组织中内源性小分子代谢物谱的模式变化情况,结果发现蛋氨酸代谢、三羧酸循环及脂肪酸代谢等代谢通路变化与酒精诱导的急性肝损伤密切相关。且模型组大鼠尿液及肝组织中部分代谢物的变化趋势与CCl4诱导的急性肝损伤大鼠的相类似。4.分别采用ECF衍生尿液的GC/MS及TMS衍生血清的GC/TOFMS方法,对肝癌患者和正常对照人群的尿液及血液进行代谢组学研究,尝试为肝癌诊断以及肝癌的病理机制理解寻找新的切入点。研究结果发现,正常人与肝癌患者尿液和血液的代谢谱均有分离趋势,进一步利用监督的正交偏最小方差判别分析（OPLS-DA）方法能清晰地观察到肝癌患者与正常对照之间尿液和血液代谢轮廓的差异,通过对代谢网络变化的分析发现了与肝癌临床病理相关的代谢通路――能量代谢、苯丙氨酸、色氨酸、糖代谢以及一些其它的氨基酸代谢的变化。本课题在建立肝组织代谢组学方法的基础上,应用传统药理学指标与代谢组学研究所揭示的生物化学变化相结合的方法,为CCl4及酒精诱导的大鼠急性肝损伤的机制研究及药物药效作用的整体评价提供新的思路和视野;并且发现代谢组学技术在肝癌的早期诊断甚至分期上有很大的潜力,可以为临床诊断提供科学依据,非常值得进行深入一步的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 前言
• 第一章 前言
• 1.1 课题背景介绍
• 1.1.1 肝损伤研究的介绍
• 1.1.1.1 肝损伤的研究背景
• 1.1.1.2 酒精性肝病的研究背景
• 1.1.2 肝癌的研究背景
• 1.1.2.1 肝癌的流行病学研究和危险因素
• 1.1.2.2 肝癌的分期
• 1.1.2.3 肝癌的治疗方法
• 1.1.2.4 肝癌研究中存在的问题
• 1.1.3 代谢组学介绍
• 1.1.3.1 代谢组学的概念及特点
• 1.1.3.2 代谢组学的研究对象
• 1.1.3.3 代谢组学的研究方法
• 1.1.3.4 代谢组学在肝脏疾病中的研究进展
• 1.2 本研究内容以及研究意义
• 1.2.1 本课题的研究内容
• 1.2.2 本课题的研究意义
• 第二部分 基于气质联用的组织代谢组学方法研究
• 第二章 肝组织代谢组学方法研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 高氯酸乙醇提取体系
• 2.3.1.1 提取方法
• 2.3.1.2 进样前衍生化反应
• 2.3.1.3 GC/MS 分析条件
• 2.3.2 氯仿/甲醇/水提取体系
• 2.3.2.1 提取方法
• 2.3.2.2 进样前衍生化反应
• 2.3.2.3 GC/MS 分析及条件设定
• 2.3.3 高氯酸乙醇提取体系方法学验证
• 2.3.3.1 标准品溶液
• 2.3.3.2 内标溶液的配置
• 2.3.3.3 标准曲线的建立
• 2.3.3.4 精密度试验
• 2.3.3.5 重复性试验
• 2.3.3.6 稳定性试验
• 2.3.3.7 加样回收试验
• 2.3.4 氯仿/甲醇/水提取体系方法学验证
• 2.3.4.1 标准品溶液
• 2.3.4.2 内标溶液的配置
• 2.3.4.3 标准曲线的建立
• 2.3.4.4 精密度实验
• 2.3.4.5 重复性试验
• 2.3.4.6 稳定性试验
• 2.3.5 数据处理方法
• 2.3.6 多维统计方法
• 2.4 结果
• 2.4.1 高氯酸乙醇提取效果
• 2.4.2 氯仿/甲醇/水提取效果
• 2.4.3 ECF 衍生化方法学验证的结果
• 2.4.3.1 线性与检测限结果
• 2.4.3.2 精密度、重复性及稳定性结果
• 2.4.3.3 回收率结果
• 2.4.4 TMS 衍生化方法学验证的结果
• 2.4.4.1 线性结果
• 2.4.4.2 标准品及肝组织样品的检测限与精密度
• 2.4.4.3 重复性及稳定性
• 2.5 讨论
• 2.5.1 提取方法
• 2.5.2 高氯酸乙醇提取
• 2.5.3 氯仿/甲醇/水提取
• 2.6 本章小结
• 2.6.1 高氯酸乙醇提取方法结论
• 2.6.2 氯仿/甲醇/水提取方法结论
• 第三部分 化学诱导急性肝损伤的代谢组学研究
• 第三章 四氯化碳诱导大鼠急性肝损伤的尿液及肝组织代谢组学研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 实验试剂
• 3.2.3 仪器与配件
• 3.3 实验方法
• 4诱导急性肝损伤模型的建立、给药方法及样本收集'>3.3.1 CCl₄诱导急性肝损伤模型的建立、给药方法及样本收集
• 3.3.2 血浆活性生化指标检测
• 3.3.3 肝组织生化指标检测
• 3.3.4 病理组织学观察
• 3.3.5 代谢组学研究方法
• 3.3.5.1 尿液样品预处理方法
• 3.3.5.2 肝组织样本预处理方法
• 3.3.6 GC/MS 分析及条件设定
• 3.3.7 数据处理和模式识别
• 3.3.7.1 色谱数据的提取与前处理方法
• 3.3.7.2 模式识别
• 3.3.8 差异表达的代谢物的鉴别
• 3.4 结果
• 3.4.1 血浆生化指标检测结果
• 3.4.2 肝组织生化指标检测结果
• 3.4.3 病理组织学结果
• 3.4.4 模型组与正常组尿液代谢模式的比较
• 3.4.5 甘利欣干预组大鼠尿样代谢物变化的比较
• 3.4.6 差异代谢物在甘利欣干预组的变化分析
• 3.4.7 模型组和甘利欣干预组大鼠尿液代谢模式随时间变化的趋势分析
• 3.4.8 肝组织代谢模式的比较
• 3.5 讨论
• 4 所致肝损伤大鼠尿液中差异代谢物分析'>3.5.1 CCl₄所致肝损伤大鼠尿液中差异代谢物分析
• 4 所致肝损伤大鼠肝组织中差异代谢物分析'>3.5.2 CCl₄所致肝损伤大鼠肝组织中差异代谢物分析
• 3.5.2.1 脂肪酸变化
• 3.5.2.2 氨基酸变化
• 3.5.2.3 甘利欣的作用机制推测
• 3.6 本章小结
• 第四章 酒精诱导肝损伤的代谢组学研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 实验动物
• 4.2.2 实验试剂
• 4.2.3 仪器与配件
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 酒精诱导肝损伤模型的建立及样本收集
• 4.3.2 血浆活性生化指标检测
• 4.3.3 肝组织生化指标检测
• 4.3.4 代谢组学研究方法
• 4.3.4.1 尿液样品预处理方法
• 4.3.4.2 肝组织样本预处理方法
• 4.3.5 GC/MS 分析及条件设定
• 4.3.6 数据处理和模式识别
• 4.3.6.1 色谱数据的提取与前处理方法
• 4.3.6.2 模式识别
• 4.3.7 差异表达的代谢物的鉴别
• 4.4 结果
• 4.4.1 血浆生化指标检测结果
• 4.4.2 肝组织生化指标检测结果
• 4.4.3 模型组与正常组代谢模式的比较
• 4.4.3.1 尿液代谢模式的比较
• 4.4.3.2 肝组织代谢模式的比较
• 4.5 讨论
• 4.5.1 酒精诱导急性肝损伤大鼠尿液及肝组织中差异代谢物分析
• 4.6 本章小结
• 第五章 基于气质联用的肝癌尿液及血清代谢组学研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 样本的采集
• 5.2.2 实验仪器及试剂
• 5.2.2.1 实验仪器
• 5.2.2.2 实验试剂
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 尿液实验方法
• 5.3.1.1 进样前衍生化反应
• 5.3.1.2 GC/MS 分析及条件设定
• 5.3.1.3 数据处理和模式识别
• 5.3.2 血液实验方法
• 5.3.2.1 进样前衍生化反应
• 5.3.2.2 GC/MS 分析及条件设定
• 5.3.2.3 数据处理和模式识别
• 5.3.3 差异代谢物的分析
• 5.4 结果
• 5.4.1 尿液代谢组学研究
• 5.4.1.1 尿液GC/MS 分析结果
• 5.4.1.2 多维统计分析
• 5.4.2 血清代谢组学研究
• 5.4.2.1 血清 GC/TOF 分析结果
• 5.4.2.2 多维统计分析结果
• 5.5 讨论
• 5.5.1 肝癌的代谢组学研究
• 5.5.2 尿液代谢组学
• 5.5.3 血清代谢组学
• 5.6 本章小结
• 5.6.1 肝癌患者尿液的代谢组学研究
• 5.6.2 肝癌患者血样的代谢组学研究
• 第四部分 结论
• 第六章 研究总结与展望
• 6.1 研究工作总结
• 6.1.1 建立肝组织代谢组学研究方法
• 4 诱导急性肝损伤的代谢组学研究'>6.1.2 CCl₄诱导急性肝损伤的代谢组学研究
• 6.1.3 酒精诱导急性肝损伤的代谢组学研究
• 6.1.4 临床肝癌病人样本的代谢组学研究
• 6.2 全文结论
• 6.3 论文创新点
• 6.4 思考及展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间主要研究成果