论文摘要
目的构建多房棘球绦虫rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗;分析重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达效率;动态观察rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗皮下注射和鼻腔粘膜接种BALB/c小鼠产生的免疫应答;通过不同途径接种rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗免疫BALB/c小鼠,再用Em原头节攻击,研究疫苗产生的保护力及其免疫机制。从而为AE的防治提供一种有价值的疫苗。方法通过PCR扩增EmⅡ/3和Em14-3-3抗原编码基因序列,然后采用序贯PCR（gene SOEing）法将EmⅡ/3和Em14-3-3编码基因用疏水甘氨酸接头（Gly4Ser）3经PCR扩增融合,定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3;用电穿孔法将该质粒导入BL21及Bb,构建多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗。SDS-PAGE及Western blot分析pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达的目的蛋白。为了研究rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗皮下注射和鼻腔粘膜接种免疫BALB/c小鼠诱导的免疫应答类型及动态变化规律,将70只雌性BALB/c小鼠随机分为2组,每组35只。皮下注射组:将5×106CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗悬浮于100μl PBS于小鼠背部皮下注射;鼻腔粘膜接种组:将5×105CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗悬浮于10μl PBS于小鼠鼻腔粘膜单次接种。ELISA方法检测各组鼠免疫后不同时间（免疫后0、2、4、6、8、10、12和14w）血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平以及脾细胞体外培养原液及在受到EmAg或ConA（LPS）刺激后分别产生的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平;用MTT比色法检测脾细胞增殖水平;用FCM检测各组鼠免疫后不同时间（免疫后0、2、4、6、8、10、12和14w）脾细胞CD4+和CD8+亚群。为了研究rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗免疫BALB/c小鼠后抗原头节攻击产生的免疫保护力及其免疫机制,将78只雌性BALB/c小鼠随机分为6组,每组13只。SC组:5×106CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗悬浮于100μl PBS于小鼠背部皮下注射;IM组:5×106CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗悬浮于100μl PBS肌肉注射;IN组:5×105CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗悬浮于10μl PBS于小鼠鼻腔粘膜单次接种;PO组:1×108CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗悬浮于60μl PBS口服接种;Bb对照组:Bb菌液皮下注射;PBS对照组:100μl PBS皮下注射。6组均于免疫12w后用Em原头节攻击。在Em原头节攻击感染后18w,用ELISA方法检测各组鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平;双抗体夹心ELISA试剂盒检测各组鼠脾细胞体外培养原液及在受到EmAg或ConA（LPS）刺激后分别产生的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平;用MTT比色法检测脾细胞增殖水平;用FCM检测脾细胞CD4+和CD8+亚群及用Annexin V-FITC试剂盒检测脾细胞原液或用ConA刺激培养时细胞凋亡发生率。结果琼脂糖凝胶电泳证实PCR扩增的EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因全长2554bp,序列分析发现其与预期结果一致;双酶切证实EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因成功插入pGEX-1λT中,成功构建能够表达目的蛋白的重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3;将含50μg/ml Amp的MRS琼脂平板筛选的rBb经PCR和质粒双酶切鉴定分析,证实pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3成功转进Bb,rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗构建成功。SDS-PAGE及Western blot分析重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导1～13h表达了119kDa的目的蛋白,占菌体总蛋白的20%,且能与鼠血清抗体发生特异性结合。动态研究发现2组特异性抗体IgG、IgG2a和IgG2b都在免疫后有不同程度的增高;而IgG1和IgG3无明显变化;IgE在免疫后10～12w达较高水平;淋巴细胞增殖在免疫后10～14w达较高水平;2组CD4+T细胞均在免疫后4～8w升高,而CD8+T细胞轻微增加;2组小鼠脾细胞原液或受EmAg和ConA刺激后,4种细胞因子在免疫后2～6w之间达高水平,其中以IFN-γ和TNF-α增加明显。疫苗免疫及原头节攻击后发现与PBS对照组相比,皮下注射组、肌肉注射组、鼻腔粘膜接种组和口服接种组小鼠检获泡球蚴质量均降低,减蚴率为13.56～78.25%,皮下注射组的减蚴率最高;免疫组IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平与PBS对照组相比显著增加,皮下注射组IgG、IgG2a和IgG2b水平明显高于其他免疫组,各免疫组IgG3和IgE水平降低;各免疫组小鼠脾细胞原液、EmAg刺激或ConA刺激后淋巴细胞增殖指数均显著高于PBS对照组;各免疫组CD4+亚群水平显著高于PBS对照组,CD8+亚群水平较PBS对照组增加,但无显著差异;与PBS对照组相比,各免疫组小鼠脾细胞IL-12、IFN-γ和TNF-α水平不同程度升高,IL-10水平降低;各免疫组小鼠脾细胞原液或ConA刺激后脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组,皮下注射组脾细胞凋亡发生率最低。结论1.通过序贯PCR成功扩增出EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因。2.成功构建了多房棘球绦虫重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3及rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗。3.多房棘球绦虫重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3能在BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,表达效率为20%,并且表达的EmⅡ/3-Em14-3-3重组蛋白具有特异的抗原性。4.rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗能诱导BALB/c小鼠产生较强的特异性CD4+Th1型细胞免疫、体液免疫和微弱的CD8+CTL反应。5.rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗能诱导BALB/c小鼠产生一定的保护力,对抗Em原头节的攻击。皮下注射诱导的保护力优于其他疫苗接种途径。
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相关论文文献
- [1].多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3疫苗的构建及其表达效率[J]. 重庆医科大学学报 2008(06)
- [2].多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗诱导小鼠细胞因子变化的研究[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2008(08)
- [3].多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对小鼠脾细胞凋亡的影响[J]. 中国人兽共患病学报 2008(11)