番茄中乙烯信号转录因子LeERF1和LeERF2调控机制研究

论文题目: 番茄中乙烯信号转录因子LeERF1和LeERF2调控机制研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 食品科学

作者: 张红星

导师: 罗云波

关键词: 番茄,乙烯,信号转导,病程胁迫

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 植物中内源激素乙烯影响植物的生长和发育。调控乙烯反应是由乙烯信号转导途径来完成的。乙烯反应元件结合蛋白(EREBPs)是乙烯信号转导途径中的下游传递元件,在植物中通过调控相关基因的转录和表达来调控乙烯反应。LeERF1和LeERF2基因属于EREBPs家族成员,含有典型的ERF结构域。为了进一步研究它们的调控机制,本论文做了以下几方面工作: (1) 克隆和鉴定LeERF1和LeERF2基因:通过RT-PCR方法从破色期番茄果实中克隆LeERFl和LeERF2基因,PCR产物被亚克隆到原核表达载体pET-30a上,在大肠杆菌BL21中筛选到含有目的基因的重组质粒pET-LeERF1和pET-LeERF2。 (2) 表达和纯化LeERF1和LeERF2蛋白:在大肠杆菌BL21中分别表达外源蛋白LeERF1和LeERF2,采用诱导温度为37℃,诱导剂IPTG浓度为lmmol/L,诱导时间为3h。LeERF1和LeERF2表达蛋白在细菌沉淀中约占菌体总蛋白53%和58%。应用Ni-NTA亲和层纯化回收LeERF1和LeERF2表达蛋白纯度分别为96%和99%。凝胶阻滞实验表明,LeERF1和LeERF2表达蛋白均具有与GCC盒结合特性。 (3) 制备抗LeERF1和LeERF2多克隆抗体:免疫兔子制备抗LeERF1多克隆抗体和抗LeERF2多克隆抗体效价均大于10000,经过DEAE-52离子交换柱纯化它们纯度分别达到了98%和99%。Western blotting检测表明,抗LeERF1多克隆抗体和抗LeERF2的多克隆抗体均具有免疫特异性。 (4) LeERF1亚细胞定位:通过胶体金免疫电镜定位的方法分析番茄果皮维管组织中LeERF1的亚细胞分布状况。研究表明,LeERF1蛋白主要分布在细胞核(N)、细胞核仁(Nu)和质体(P)等部位,而在细胞壁(Cw)和液泡(V)上几乎没有分布;破色期番茄果实中,LeERF1蛋白在细胞核(N)、细胞核仁(Nu)和质体(P)中含量明显比绿熟期番茄果实增多。Western blotting表明,破色期番茄果实中LeERF1蛋白含量比绿熟期番茄果实中LeERF1蛋白含量有明显增加。试验结果表明,LeERF1与番茄果实成熟相关。 (5) LeERF1结合启动子的分离和功能鉴定:通过LeERF1蛋白-DNA体外结合实验,克隆了长度分别为893bp和734bp的TLBP1和TLBP2两个基因片断,它们都含有AGCCGCC(GCC盒),其中厂LBP1含有典型IATA box和CAAT box。GenBank比对结果表明,TLBP1和TLBP2基因片段与编码番茄几丁质酶AY343058/AY343059/AY343060的启动子基因在核甘酸水平上同源性达到80%以上。 (6) LeERF1蛋白和番茄果实病程胁迫的关系:采用番茄青霉菌(Penicillium expansum Link)侵染绿熟期、破色期、粉红期和红熟期丽春番茄果实。研究表明,LeERF1随乙烯释放量的变化而变化,在蛋白水平受乙烯调控;LeERF1蛋白与编码几丁质酶LECHI17基因mRNA水平变化趋势基本一致;LECHI17基因mRNA水平与几丁质酶酶活具有相关性。试验表明,LeERF1可能在蛋白水平通过调控LECHI17基因的转录和翻译参与番茄果实的病程胁迫反应。

论文目录:

插图、附表清单

缩略语表

第一章 文献综述

1.1 乙烯的生物合成

1.1.1 ACC合酶(ACS)

1.1.2 ACC氧化酶(ACO)

1.2 乙烯信号转导

1.2.1 乙烯受体

1.2.2 CTR和蛋白激酶

1.2.3 EIN2

1.2.4 EIN3 and EIL

1.2.5 乙烯反应元件结合蛋白(EREBPs)

1.3 信号转录因子

1.3.1 转录因子的结构和功能

1.3.2 番茄中乙烯信号EREBPs转录因子

1.4 研究目的与内容

1.4.1 研究目的、意义

1.4.2 研究内容

第二章 LeERF1和LeERF2基因克隆和序列分析

2.1 材料与试剂

2.1.1 材料

2.1.2 酶及试剂

2.1.3 试剂的配制

2.1.4 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 破色期番茄果实总RNA提取

2.2.2 RT-PCR扩增LeERF1和LeERF2基因

2.2.3 LeERF1和LeERF2基因的克隆

2.2.4 DNA序列测定及分析

2.3 结果与分析

2.3.1 重组质粒pET-LeERF1的构建过程

2.3.2 破色期番茄果实总RNA提取

2.3.3 LeERF1基因的RT-PCR扩增

2.3.4 重组pET-LeERF1质粒的构建和鉴定

2.3.5 LeERF1基因序列结果和分析

2.3.6 重组pET-LeERF2质粒的构建过程

2.3.7 LeERF2基因的RT-PCR扩增

2.3.8 重组pET-LeERF2质粒的构建和鉴定

2.3.9 LeERF2基因序列结果和分析

2.4 讨论

第三章 LeERF1和LeERF2基因在原核细胞中的表达和亲和层析纯化

3.1 材料与试剂

3.1.1 菌株与质粒

3.1.2 试剂

3.1.3 溶液配制

3.2 实验方法

3.2.1 LeERF1和LeERF2基因在大肠杆菌BL21中的表达

3.2.2 蛋白表达条件优化

3.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

3.2.4 蛋白质纯化方案

3.2.5 EMSA

3.3 结果与分析

3.3.1 LeERF1和LeERF2蛋白表达条件优化

3.3.2 亲和层析纯化和回收LeERF1和LeERF2蛋白

3.3.3 EMSA

3.4 讨论

第四章 番茄乙烯信号转录因子LeERF1／2多克隆抗体制备

4.1 材料与试剂

4.1.1 材料

4.1.2 试剂

4.1.3 主要溶液

4.2 方法

4.2.1 多克隆抗体制备方案

4.2.2 间接ELISA法检测血清效价

4.2.3 多克隆抗体的纯化

4.2.4 Western blotting检测多克隆抗体

4.3 结果与分析

4.3.1 LeERF1抗体的制备

4.3.2 LeERF2抗体的制备

4.3.3 Western blotting检测多克隆抗体

4.4 讨论

第五章 番茄果实成熟过程中LeERF1的亚细胞定位

5.1 材料与试剂

5.1.1 材料

5.1.2 试剂

5.1.3 主要溶液

5.2 方法

5.2.1 样品包埋

5.2.2 胶体金免疫染色

5.2.3 番茄果实蛋白质的提取

5.2.4 Western blotting

5.3 结果与分析

5.3.1 绿熟期番茄果实中LeERF1的亚细胞定位

5.3.2 破色期番茄果实中LeERF1的亚细胞定位

5.3.3 试验对照

5.3.4 Western blotting

5.4 讨论

第六章 LeERF1特异性结合启动子的分离和功能鉴定

6.1 材料与试剂

6.1.1 试验材料

6.1.2 酶及试剂

6.1.3 试剂配制

6.2 方法

6.2.1 提取番茄总DNA

6.2.2 随机引物设计

6.2.3 随机引物PCR扩增

6.2.4 体外结合反应

6.2.5 乙烯信号转录因子LeERF1结合基因的克隆

6.2.6 银染凝胶阻滞试验

6.3 结果与分析

6.3.1 番茄基因组DNA提取

6.3.2 随机引物扩增番茄基因组DNA

6.3.3 银染凝胶阻滞试验检测LeERF1蛋白与启动子TLBF1／2的结合反应

6.4 讨论

第七章 乙烯信号转录因子LeERF1与番茄果实病程胁迫的关系

7.1 材料与试剂

7.1.1 试验材料

7.1.2 酶及试剂

7.1.3 试剂的配制

7.2 方法

7.2.1 番茄果实蛋白质的提取

7.2.2 番茄果实总RNA提取

7.2.3 RT-PCR扩增基因

7.2.4 扩增基因鉴定

7.2.5 番茄果实乙烯释放量和几丁质酶酶活的检测

7.2.6 Western blotting

7.3 结果与分析

7.3.1 番茄青霉菌侵染绿熟期番茄果实

7.3.2 番茄青霉菌侵染破色期番茄果实

7.3.3 番茄青霉菌侵染粉红期番茄果实

7.3.4 番茄青霉菌侵染红熟期番茄果实

7.3.5 番茄果实中CHIT-1基因片段的克隆和测序

7.3.6 番茄果实中基因片段ubil23的克隆和测序

7.4 讨论

第八章 结论

参考文献

附录

致谢

个人简历

发布时间: 2005-07-18

参考文献

• [1].转录因子SlBEL11调控番茄果实叶绿素代谢和成熟的分子机制研究[D]. 孟兰环.中国农业大学2018
• [2].全基因组关联分析挖掘调控番茄果实苹果酸积累的关键基因[D]. 叶杰.华中农业大学2015
• [3].番茄果实糖代谢中关键SlSWEETs基因的鉴定及其功能验证[D]. 冯超阳.沈阳农业大学2018
• [4].生长素及生长素-乙烯互作调控番茄果实成熟的效应与机理[D]. 李家寅.浙江大学2017
• [5].脱落酸代谢途径与信号转导关键基因调控樱桃和番茄果实成熟分子机制的研究[D]. 孙宇飞.中国农业大学2017
• [6].增强番茄果实颜色基因的精细定位及相关基因的差异表达[D]. 王孝宣.中国农业科学院2004
• [7].番茄常温可食涂膜保鲜的理论与方法[D]. 王昕.吉林大学2004
• [8].番茄中病毒诱导基因沉默体系的建立及LeEIN2基因功能分析[D]. 傅达奇.中国农业大学2005
• [9].番茄Aux/IAA基因的克隆与功能分析[D]. 张俊红.华中农业大学2006
• [10].番茄果实特异启动子在柑橘中的活性分析及柑橘果实差异表达基因的分离[D]. 张岚岚.浙江大学2007

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• [5].番茄中病毒诱导基因沉默体系的建立及LeEIN2基因功能分析[D]. 傅达奇.中国农业大学2005
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