滩寒杂交羊PRNP等位基因密码子136、154和171的多态性研究

论文摘要

【目的】本研究拟以绵羊PRNP等位基因高变区扩增片段为研究对象进行PCR-SSCP优化试验,以期建立适合于绵羊PRNP等位基因多态性研究的PCR-SSCP分析方法;用PCR-SSCP技术分析甘肃省永昌羊场104只健康滩寒杂交绵羊（滩羊×小尾寒羊）（♀）PRNP等位基因多态性,以了解和掌握此绵羊群体PRNP 136、154和171位密码子等位基因型频率分布,并依此评估其罹患绵羊痒病的可能性。同时,筛选出用于抗痒病育种的ARR纯合子或ARR杂合子等位基因型绵羊个体,为下一步抗痒病育种计划提供基础种羊。【方法】试剂盒法提取绵羊全血基因组DNA,设计特异性引物扩增绵羊PRNP等位基因目的片段。（1）以此扩增产物为试验材料,就交联度、凝胶浓度、甘油浓度、电泳电压、电泳时间、上样量、PCR产物与变性缓冲液比例、电泳缓冲液离子浓度等影响SSCP分析的因素进行优化,建立绵羊PRNP等位基因目的片段PCR-SSCP分析法。（2）进行各扩增产物的琼脂糖凝胶电泳、纯化回收目的片段、连接pMD-18T载体、转化E.coli DH5α,于LB平板（Amp+）上培养后,挑取无色透明菌落,以PCR扩增、双酶切、SSCP法鉴定并筛选出阳性克隆后测序。应用DNA Star软件比对分析测序结果并确定各绵羊PRNP 136、154和171位密码子等位基因型,经数学统计分析不同等位基因型的频率分布,并对此绵羊群体痒病易感性做出评估。【结果】PCR-SSCP优化试验表明,PCR产物与变性缓冲液比例为1﹕4、电泳缓冲液为0.5×TBE、上样量≥2.0μL且<4.0μL、交联度49﹕1、凝胶浓度12%、甘油浓度0%、电泳电压200V、4℃条件下电泳45h为最佳条件优化组合。从104只绵羊中共检出15个PRNP 136、154和171位密码子等位基因型,其中:痒病易感基因型（ARQ/ARQ,n=38;ARQ/ARH,n=11;VRQ/ARQ,n=5;ARH/ARH,n=2）占53.85%（56/104）,半抗性基因型（ARR/ARQ,n=12;ARR/ARH,n=1）计12.50%（13/104）,抗性基因型（ARR/ARR）为22.12%（23/104）,未知与痒病关系的其他基因型（ARK/ARQ,n=4;ARK/ARH,n=2;AHR/ARQ,n=1;TRQ/TRQ,n=1;TRQ/ARR,n=1;TRQ/ARQ,n=1;ARQ/ARP,n=1;ARK/ARK,n=1）共计11.54%（12/104）,其中ARQ/ARP为首次发现。另发现18个其他突变位点,其中L141F、R167G、N176Y和Q189L为已发现突变位点,Y131N、L133P、G134R、E149V、M157T、Y158H、N162P、Y166D、F178S/L、C182S、E199V/M/L、N200I、F201S、M209T为新发现的14个突变位点,数目最多的为E189L（33/208）、R167G（9/208）、L141F（8/208）,其余突变频率很低（约0.48～1.92%）。【结论】本研究所建立的绵羊PRNP等位基因多态性PCR-SSCP分析法,经分析应用证明是稳定可靠的。在104只健康滩寒杂交绵羊中,PRNP密码子136、154和171的痒病易感基因型ARQ/ARQ、ARQ/ARH、VRQ/ARQ和ARH/ARH占优势（53.85%,56/104）,该绵羊群属于痒病易感/易发群体,一旦痒病传入具有罹患痒病的极大可能性。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩写词英汉对照表
• 第一章 绪论
• 1 绵羊PRNP 等位基因多态性及其与痒病相关性研究现状
• 1.1 绵羊PRNP 等位基因136、154 和171 位密码子的多态性
• 1.2 绵羊PRNP 等位基因多态性与痒病发生的关系
• 1.2.1 绵羊PRNP 等位基因136、154 和171 密码子多态性与痒病发生的关系
• 1.2.2 绵羊PRNP ORF 内其他密码子的多态性及其与抗痒病发生的关系
• 1.3 绵羊PRNP 等位基因多态性与绵羊生产性能的关系
• 1.4 绵羊痒病与其他基因的相关性研究
• 1.5 基因多态性研究的常用技术与方法
• 1.6 存在的问题及展望
• 2 研究的目的和意义
• 3 研究的内容和方法
• 第二章 绵羊PRNP 等位基因PCR-SSCP分析条件的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 绵羊血样
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 绵羊基因组DNA 提取
• 1.2.2 引物的设计与合成
• 1.2.3 PRNP 等位基因DNA 片段的PCR 扩增和电泳
• 1.2.4 SSCP 分析条件优化试验
• 2 结果与分析
• 2.1 绵羊基因组DNA 提取物检测
• 2.2 PRNP 等位基因DNA 片段PCR 扩增产物的电泳
• 2.3 SSCP 分析条件优化
• 2.3.1 第一轮优化
• 2.3.2 第二轮优化
• 2.3.3 SSCP 分析最佳条件优化
• 3 讨论
• 第三章 滩寒杂交绵羊PRNP 密码子136、154和171 多态性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 血样
• 1.1.2 菌株及质粒载体
• 1.1.3 工具酶及其它相关试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 绵羊基因组DNA 提取
• 1.2.2 引物的设计与合成
• 1.2.3 目的DNA 片段的PCR 扩增
• 1.2.4 绵羊PRNP 等位基因纯合子、杂合子的SSCP 分析
• 1.2.5 绵羊PRNP 等位基因的克隆及其筛选与鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 绵羊PRNP 等位基因纯合子、杂合子的SSCP 分析
• 2.2 绵羊PRNP 等位基因克隆的鉴定
• 2.2.1 PCR 扩增鉴定
• 2.2.2 限制性酶切分析
• 2.2.3 SSCP 分析鉴定
• 2.2.4 阳性克隆测序结果比对与变异位点分析
• 3 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介