论文摘要
药用植物内生真菌是新天然活性物质的重要资源,系统的调查研究药用植物的内生真菌十分必要。血竭和沉香是在机械损伤、真菌、昆虫等的作用下产生的。在自然环境条件下,不仅产量低,而且生产周期长,同时过度的开发利用造成了基源植物小花龙血树和白木香资源的枯竭。本文以小花龙血树、白木香和降香黄檀3种药用植物作为研究对象,对其内生真菌及诱导产生血竭和沉香的活性菌株进行了研究。通过表面组织消毒法从小花龙血树、白木香和降香黄檀3种植物根、茎和叶的450个组织块中分离获得581株内生真菌菌株,其中龙血树中172株,白木香128株,降香黄檀281株。根据形态特征进行初步合并为336株并对其进行鉴定,归属于32个属的46个分类单元和8个形态型。对各植物中内生真菌的定植率、分离率进行统计分析,发现在3种植物中,以小花龙血树的内生真菌总定植率最高（80.0%）,分离率则是降香黄檀（1.87）＞小花龙血树（1.15）＞白木香（0.85）。从组织水平来看,不同植物的不同器官受侵染的程度也不同。每种植物中获得的内生真菌种数不同,不同植物中同一内生真菌的分布也不同,且存在数量上的差异。小花龙血树内生真菌分属于23个属的41个分类单元优势种为镰刀菌Fusarium sp.1（6.7%）;白木香内生真菌分属于17个属的28个分类单元,镰刀菌Fusarium sp.4（7.1%）,结香枝孢Cladosporiumedgeworthrae（5.7%）,镰刀菌Fusarium sp.1（5.7%）和聚孢霉菌Glomerulariasp.（5.7%）为主要内生真菌种类;降香黄檀内生真菌分属于12个属的20个分类单元,细交链孢菌Alternaria alternata（8.3%）为优势种,主要分自叶部。利用琼脂块法对336株内生真菌进行抗6种临床病原微生物的筛选,发现37株内生真菌对一种或多种指示菌有抑制作用,其中发现29株（21.64%）来自小花龙血树,4株（7.14%）来自白木香和3株（2.27%）来自降香黄檀。抗菌活性菌株主要集中在小花龙血树内生真菌茎部。所有的菌株对大肠杆菌均没有抑制作用。活性菌株的抑制作用较单一,主要集中在枯草芽孢杆菌和烟曲霉。内生真菌对病原真菌的抑制与病原细菌的抑制作用相当。抑菌圈直径（含菌片直径5mm）的范围从7mm至27mm不等。7株内生真菌抑菌圈直径大于20mm表现出很高的抗真菌活性,主要是作用于烟曲霉。4株真菌表现出广谱的抑菌活性。活性菌株分属于10个分类单元,主要分布于齿梗孢属Calcarisporium、镰刀菌属Fusarium、附球霉属Epicoccum、曲霉属Aspergillus、青霉属Penicillium、木霉属Trichoderma、mitosporic Eremomycetaceae和未知真菌。镰刀菌属为活性菌株的优势属。在本实验中发现同属的内生真菌可能表现出不同的抑菌谱和抑制能力,如镰刀菌属内生真菌。以内生真菌作为诱导子,与剑叶龙血树组培苗共培养,未能发现促进其生长和红色物质分泌的活性菌株。对活体和死体小花龙血树进行了真菌的回接实验,未能发现促进死体小花龙血树分泌红色物质的菌株。获得10株能促进成年小花龙血树木质部分泌红色物质（血竭主要成分）的菌株,主要隶属于镰刀菌属Fusarium、拟小卵孢属Ovulariopsis、头孢霉属Cephalosporium、笋顶孢霉属Acrostalagmus和未知菌株。对其中产红色树脂量较大的5个样品利用RP-HPLC（DAD）法进行检测,发现接种菌株DC-1-12和DC-1-22的处理组中8个组分的含量均高于天然血竭,以菌株DC-1-22尤为突出。而且在我们的实验中,接种真菌仅3-5个月后,就能观察到在真菌的接种口周围有红色树脂分泌,表明人工加入诱导物,能加速诱导小花龙血树产生血竭,并有利于血竭有效组分含量的增加。对接种菌株DC-1-12和DC-1-22的处理组产生红色树脂部位进行了菌株再分离,经形态和分子鉴定,证实重新获得了菌株DC-1-22。利用显微观察发现菌丝侵入植物体内后,在细胞间生长、蔓延,到达次生维管束,与之相互作用,植物发生一种防卫反应,产生一种具有防御作用的红色分泌物。该红色分泌物首先在维管束内部形成,后逐渐向外围扩展,到达基本组织。同时发现红色分泌物形成后期整个维管束遭到破坏。对成年白木香树进行了真菌的回接实验,发现7株促进成年白木香产生棕色树脂（沉香）的内生真菌菌株。主要分属于镰刀菌属Fusarium、头孢霉属Cephalosporium、青霉属Penicillium和未知菌株。其中效果最好的为2株镰刀菌属真菌AS-1-11和AS-1-17,分泌物上下延伸达60 mm。用气相色谱-质谱联用分析了接种菌株AS-1-11和AS-1-17样品中挥发油的组分,发现菌株AS-1-11和AS-1-17作用于白木香能提高部分组分的含量。在试验中观察到接种真菌培养物后4-6个月就能产生棕色树脂。表明内生真菌在一定程度上能促进白木香产生沉香。同时发现仅在机械处理的情况下也能产生沉香。对接种菌株AS-1-11和AS-1-17的处理组产生棕色树脂部位进行了菌株再分离,经形态和分子鉴定,证实重新分离得到了菌株AS-1-11和AS-1-17。利用显微观察发现菌丝能在植物体内存活,并蔓延到达射线或导管,与其相互作用产生一种具有抗真菌的作用棕色分泌物。这是植物为抵抗真菌的侵染发生一种应激防卫反应的产物。