瘦肉型猪精液N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶同工酶的分离纯化与性质研究

论文摘要

通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱、Sephadex G-100分子筛柱和CM-52阳离子交换柱,从猪精液中提取出碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase,EC 3.3.1.52,简称NAGase）和酸性NAGase,比活力分别为17606.15 U/mg和1773.25 U/mg。两种酶的提取液经PAGE检测,均呈现一条蛋白条带。碱性NAGase经SDS-PAGE平板电泳呈现1种蛋白条带,亚基分子质量为64.30 kD,酸性NAGase则呈现2种蛋白条带,亚基分子质量分别为129.13 kD和62.24kD。碱性NAGase和酸性NAGase的等电点分别为9.42和5.10。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖（pNP-NAG）为底物,进行酶催化底物水解的反应动力学研究,结果表明:碱性NAGase和酸性NAGase催化底物反应的最适pH都是5.50,分别在pH3.0～8.90和pH 3.6～9.2区域较稳定;最适温度分别为50℃和60℃,酶活力分别在10℃～45℃和10℃～55℃的范围内保持稳定。碱性NAGase符合米氏双曲线方程,对于酸性NAGase,当底物浓度低于0.7 mmol/L时符合,底物浓度高于0.7 mmol/L时出现了底物抑制酶活性的现象。测得碱性NAGase米氏常数Km为1.94 mmol/L,最大反应速度Vm为27.53μmol/L/min,催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为88.73 kJ/mol。酸性NAGase米氏常数Km为0.46 mmol/L,最大反应速度Vm为17.34μmol/L/min,催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为41.70 kJ/mol。研究金属离子对碱性NAGase的影响。结果表明:低浓度（1～10 mmol/L）的Na+和K+对酶活力没有影响。Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、高浓度（0.1～1 mol/L）的Na+和K+对酶活力有不同程度的抑制作用。Zn2+、Ca2+、高浓度的Na+和k+对酶的抑制都表现为可逆非竞争性抑制类型,高浓度的Na+和K+对酶的抑制常数KI分别为0.47mol/L和0.32mol/L;Zn2+对酶的抑制常数KI为3.27 mmol/L;Ca2+对酶的抑制常数KI为65.28 mmol/L。在特定浓度范围内,果糖、D-甘露糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖对碱性NAGase活力有不同程度的抑制作用。D-甘露糖对酶的抑制表现为可逆竞争性类型,它的抑制常数KI为18.36 mmol/L。N-乙酰-D-氨基葡萄糖对酶的抑制类型是可逆混合型抑制类型,抑制常数KI与KIS分别为16.98 mmol/L和55.26 mmol/L。低浓度（2～20μg/mL）的恩诺沙星、环丙沙星、氯霉素、氟苯尼考对碱性NAGase活力没有影响。高浓度（0.1～1 mg/mL）的磺胺对甲氧嘧啶对酶活力没有影响。高浓度（0.1～1.5 mg/mL）的恩诺沙星和环丙沙星对酶活力有一定抑制作用。高浓度（0.2～2mg/mL）氯霉素有抵抗乙醇对酶活力的抑制作用。头孢拉定（0.5～15 mg/mL）对酶有先激活后抑制作用。对于常用精液稀释液的主要成分,EDTA2Na和VitaminC对碱性NAGase活力有激活作用,三羟甲基氨基甲烷（Tris）、碳酸氢钠、葡萄糖、柠檬酸三钠对酶活力有不同程度的抑制作用,Tris对酶活力的抑制作用最强,表现为可逆非竞争性类型,抑制常数为9.81 mmol/L。青霉素钾、硫酸链霉素和L-半胱氨酸对酶活力没有影响。研究采精频率对酶活力的影响和比较不同品种猪精液NAGase活力。结果表明:一周采精两次对精浆NAGase活力没有影响,隔天采精和连续采精会导致精浆NAGase活力下降.。杜洛克精浆NAGase活力比大约克、皮杜高,具有统计学上的差异（P＜0.05）。3个品种每毫升精液的精子中NAGase含量不存在明显区别。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 实验材料、仪器与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验试剂
• 2.3 仪器设备
• 2.4 试验方法
• 2.4.1 蛋白质浓度的测定
• 2.4.2 酶活力的测定
• 2.4.3 酶的分离纯化
• 2.4.4 酶的性质测定
• 2.4.5 酶催化反应的动力学性质的研究
• 2.4.6 效应物对碱性NAGase活力的影响
• 2.4.7 不同品种精液NAGase活力比较以及采精频率对酶活力的影响
• 3 实验结果
• 3.1 酶的分离纯化与纯度鉴定
• 3.1.1 碱性NAGase的分离纯化与纯度鉴定
• 3.1.2 酸性NAGase的分离纯化与纯度鉴定
• 3.2 酶的理化性质
• 3.2.1 酶分子的亚基分子量
• 3.2.2 酶的等电点
• 3.3 酶催化底物pNP-β-D-GlcNAc水解反应的动力学性质
• 3.3.1 温度对酶活力的影响和酶的热稳定性
• 3.3.2 pH对酶活力的影响和酶的酸碱稳定性
• 3.3.3 酶催化底物pNP-β-D-GlcNAc水解反应的动力学参数测定
• 3.3.4 酶催化底物pNP-β-D-GlcNAc水解反应的活化能测定
• 3.4 金属离子对酶活力的影响
• +、K⁺对猪精液碱性NAGase的影响'>3.4.1 Na⁺、K⁺对猪精液碱性NAGase的影响
• 2+对猪精液碱性NAGase的影响'>3.4.2 Zn²⁺对猪精液碱性NAGase的影响
• 2+、Mg²⁺对猪精液碱性NAGase的影响'>3.4.3 Ca²⁺、Mg²⁺对猪精液碱性NAGase的影响
• 2+对猪精液碱性NAGase的影响'>3.4.4 Cu²⁺对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.5 单糖对酶活力的影响
• 3.5.1 果糖对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.5.2 D-甘露糖对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.5.3 N-乙酰-D-氨基葡萄糖对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.6 抗生素对酶活力的影响
• 3.6.1 恩诺沙星、环丙沙星、磺胺对甲氧嘧啶、氟苯尼考对碱性NAGase的影响
• 3.6.2 氯霉素对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.6.3 头孢拉定对猪精液碱性NAGade的影响
• 3.7 常用精液稀释的主要成分对酶活力的影响
• 3.7.1 双抗对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.7.2 葡萄糖对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.7.3 EDTA钠盐对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.7.4 柠檬酸三钠对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.7.5 L-半胱氨酸对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.7.6 碳酸氢钠对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.7.7 维生素C对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.7.8 Tris对猪精液碱性NAGase的影响
• 3.8 不同品种精液NAGase活力比较以及采精频率对酶活力的影响
• 3.9 采精频率对酶活力的影响
• 4 讨论
• 4.1 酶的分离纯化与理化性质
• 4.2 金属离子对碱性NAGase的影响
• 4.3 单糖对碱性NAGase活力的影响
• 4.4 抗生素对碱性NAGase活力的影响
• 4.5 精液稀释液主要成分对碱性NAGase活力的影响
• 4.6 不同品种精液NAGase活力比较以及采精频率对酶活力的影响
• 结论
• 参考文献
• 致谢