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抗菌肽Cecropin B-肿瘤血管生长抑制因子Kringle5 融合蛋白表达载体的构建及其表达

2020-11-21阅读(918)

抗菌肽Cecropin B-肿瘤血管生长抑制因子Kringle5 融合蛋白表达载体的构建及其表达

论文摘要

抗菌肽(antibacterial peptide,ABP)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽,分子量在2000到7000左右,由20到60个氨基酸残基组成。Cecropin B(天蚕素B)是由Boman最早从天蚕体内分离到的,是一类可诱导的、小分子量、热稳定性、广谱抗菌的可溶性抗菌肽。天蚕素B不仅具有广谱的抗菌作用,还能能选择性杀伤肿瘤细胞,天蚕素B对人髓样白血病细胞、艾氏腹水瘤、宫颈癌细胞、直肠癌及肝癌细胞均有杀伤作用,但对正常的哺乳动物细胞和昆虫细胞却无不良影响。Angiostatin是纤溶酶原(plg)的降解片断,主要由纤溶酶原的前四个饼环区组成。1997年,Cao等发现纤溶酶原的第五个饼环区(plasminogen kringle5,hPgnK5)同样具有抑制血管内皮细胞增殖和肿瘤生长的能力,且抑制能力强于Angiostatin。正常的肿瘤的发生、发展和转移必须依赖于新血管的生成,Kringle5对新血管生长的抑制作用表现为对肿瘤血管生长的抑制。通过对血管生长的抑制作用而强烈的抑制肿瘤细胞的生长,使肿瘤组织萎缩、消失。 本研究主要通过基因重组的方法,将Cecropin B和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5的编码基因连接到高效的大肠杆菌表达载体pET32a上进行融合表达。首先根据GenBank中抗菌肽Cecropin B基因序列和相关资料,利用大肠杆菌偏爱密码子设计抗菌肽Cecropin B基因序列,将整个基因划分为A、B、C、D共4个片段,分别合成。通过重叠区扩增法(Gene splicing method of overlap extension,gene SOEing)合成完整的天蚕抗菌肽基因。根据肿瘤血管生长抑制因子Kringle5基因上下游的碱基序列设计上下游引物,通过PCR以已有的含有该基因的质粒为模板扩增出完整的Kringle5基因。 将PCR扩增出来的CB基因、K5基因和表达性载体pET32a分别用相应的限制性内切酶切割后,凝胶电泳回收目的条带,然后用T4 DNA连接酶将三者连接。将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经酶切鉴定和测序,表

论文目录

  • 第一部分 文献综述
  • 1. 肿瘤的研究进展
  • 1.1 肿瘤的生长过程
  • 1.2 肿瘤的转移机制
  • 1.3 肿瘤的生长、转移与血管生成的关系
  • 2. 抗菌肽研究进展
  • 2.1 抗菌肽的发现、结构、分类、性质、作用机制
  • 2.1.1 抗菌肽的发见
  • 2.1.2 抗菌肽的结构特点、分类及理化性质
  • 2.1.3 抗菌肽的作用机理研究进展
  • 2.2 抗菌肽的生物功能及在抗肿瘤细胞方面的作用机理
  • 2.2.1 抗菌肽的生物功能
  • 2.2.2 抗菌肽在抗肿瘤细胞方面的作用机理
  • 2.3 抗菌肽的应用前景
  • 2.3.1 在食品方面的应用
  • 2.3.2 在医药方面的应用
  • 2.3.3 在农业上的应用
  • 2.4 抗菌肽分子生物学研究进展
  • 2.5 抗菌肽基因工程
  • 2.6 抗菌肽转基因研究
  • 3. 肿瘤血管生长抑制因子研究进展及肿瘤的抗血管生成疗法
  • 3.1 肿瘤血管生长抑制因子
  • 3.2 肿瘤血管生长抑制因子kringle 5
  • 3.3 肿瘤的抗血管生成疗法
  • 3.4 Kringle5的基因工程药物开发及应用
  • 4 本研究的意义和内容
  • 第二部分 材料和方法
  • 1. 主要试剂与仪器
  • 1.1 基本试剂及生产厂家
  • 1.2 酶和其他试剂
  • 1.3 本试验所用的菌株及质粒
  • 1.4 主要仪器和厂家
  • 2. 实验方法
  • 2.1 融合蛋白的序列设计
  • 2.2 抗菌肽cecropin B基因的获得
  • 2.3 肿瘤血管生长抑制因子K5的获得
  • 2.4 表达型载体pET32a的制备
  • 2.5 目的基因片段和表达型载体的限制性酶切反应
  • 2.6 酶切产物的纯化
  • 2.7 CB和K5酶切片段与pET32a酶切片段的酶连
  • 2.8 大肠杆菌BL21（DE3）感受态的制备
  • 2.9 pET32a/CB-K5转化BL21（DE3）感受态细胞
  • 2.10 重组表达载体转化菌落的筛选及测序鉴定
  • 2.11 重组蛋白的诱导表达及纯化
  • 第三部分 结果与分析
  • 1. CB的合成
  • 1.1 片段1与片段2PCR结果和片段3与片段4的PCR结果
  • 1.2 CB全长的PCR结果
  • 2. k5基因的PCR扩增
  • 3. 重组表达载体的PCR鉴定及测序
  • 3.1 重组表达载体的PCR鉴定
  • 3.2 测序结果
  • 测序由上海基康公司完成，采用T7teminator作为测序引物。
  • 4. 融合蛋白的诱导表达
  • 5. 融合蛋白的纯化
  • 2+螯合的Sepharose Fast Flow层析'>5.1 Cu2+螯合的Sepharose Fast Flow层析
  • 5.2 Sephadex G 25柱层析
  • 5.3 纯化蛋白的SDS-RAGE电泳检测
  • 第四部分 讨论
  • 第五部分 结论
  • 第六部分 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

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    • [2].High-level expression of housefly cecropin A in Escherichia coli using a fusion protein[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2010(06)
    • [3].家蝇Cecropin基因的原核表达及表达产物的免疫学鉴定[J]. 中国人兽共患病学报 2009(05)
    • [4].抗菌肽Cecropin及其在转基因植物抗菌中的应用[J]. 中国生物工程杂志 2008(05)
    • [5].天蚕素抗菌肽的研究与应用[J]. 黑龙江畜牧兽医 2017(17)
    • [6].Study on Preventive Effect of Cecropin and Lysozyme on Skin Fester Disease in Trionyx sinensis[J]. Animal Husbandry and Feed Science 2017(06)
    • [7].Stability and orientation of cecropin P1 on maleimide self-assembled monolayer(SAM) surfaces and suggested functional mutations[J]. Chinese Chemical Letters 2015(04)
    • [8].天蚕素抗菌肽的性质、功能及应用研究进展[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版) 2014(07)
    • [9].家蚕抗菌肽基因Cecropin-D的克隆及其真核表达载体的构建[J]. 北方蚕业 2010(04)
    • [10].猪抗菌肽cecropin-P1单克隆抗体的制备[J]. 上海畜牧兽医通讯 2008(04)
    • [11].高剂量Cecropin AD对10-20kg阶段仔猪的饲用效果[J]. 中国动物保健 2008(10)
    • [12].家蚕抗菌肽Cecropin-XJ的原核优化表达及活性检测[J]. 蚕业科学 2012(05)
    • [13].抗菌肽Cecropin A基因原核表达及表达产物的鉴定(英文)[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2011(24)
    • [14].抗菌肽Cecropin D基因在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析[J]. 中国预防兽医学报 2011(11)
    • [15].重组猪源抗菌肽Cecropin P1在毕赤酵母中的分泌表达与活性研究[J]. 化学与生物工程 2011(09)
    • [16].柞蚕抗菌肽cecropin B的结构和抑菌活性及基因表达分析[J]. 蚕业科学 2019(05)
    • [17].家蚕抗菌肽cecropin A的表达特征及其体内外抑菌研究[J]. 基因组学与应用生物学 2016(06)
    • [18].抗菌肽cecropin P1在大肠杆菌中的融合表达及活性测定[J]. 食品与药品 2011(01)
    • [19].家蚕抗菌肽Cecropin D基因的原核表达、纯化及抑菌活性测定[J]. 中国蚕业 2011(04)
    • [20].蛔虫抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定[J]. 中国病原生物学杂志 2010(02)
    • [21].Hybrid Antimicrobial Peptide Buforin Ⅱ-Cecropin B Exhibits Antimicrobial Activity[J]. Agricultural Biotechnology 2015(01)
    • [22].抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定[J]. 中国生物制品学杂志 2008(03)
    • [23].重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1在毕赤酵母中的表达及抑菌活性[J]. 中国兽医学报 2011(08)
    • [24].抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究[J]. 饲料工业 2011(19)
    • [25].抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达的研究[J]. 中国畜牧杂志 2010(05)
    • [26].CecropinXJ抑制肝癌BEL-7402细胞增殖及机制研究[J]. 中国中医急症 2018(09)
    • [27].猪蛔虫抗菌肽Cecropin p基因的克隆及其原核表达载体的构建[J]. 江西师范大学学报(自然科学版) 2012(05)
    • [28].猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2基因的真核表达及表达产物的抗菌活性研究[J]. 中国兽药杂志 2012(05)
    • [29].串联抗菌肽Cecropin B基因在莱茵衣藻中的表达及其抗菌活性分析(英文)[J]. 生物化学与生物物理进展 2012(04)
    • [30].AtNPR1和Cecropin B基因共表达载体的构建[J]. 浙江农业科学 2020(05)

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