论文题目: 缺失nifZ的棕色固氮菌突变株DJ194的钼铁蛋白研究——纯化、结晶及金属簇的组成与分布
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物学
作者: 周会娜
导师: 黄巨富
关键词: 棕色固氮菌突变种,缺失的固氮酶蛋白,细菌铁蛋白,纯化和特性,结晶
文献来源: 中国科学院研究生院（植物研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE-52、Sephacryl S-200及Q-Sepharose等柱厌氧层析,分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Av1）制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZ Av1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白:属于热激蛋白60家族（Hsp 60 family）成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶（6-Phosphate Glucose Isomerase,PGI）及棕色固氮菌细菌铁蛋白（Bacterioferritin,Bfr）。初步鉴定表明,它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体,62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZ Av1蛋白,但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZ Av1亚基具有相似的迁移率,互相重叠,从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZ Av1纯度; 而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZ Av1,但往往会在ΔnifZ Av1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来,从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰（Zhao等,2004）。通过Sephacryl S-200柱洗脱峰收集精度的调整及Q-Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱,得到了纯度大于90%的ΔnifZ Av1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍（Western blotting）,以及SDS-变性凝胶电泳显出,ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白（OP Av1）相似,表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZ Av1的α2β2四聚体构成。ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号（g≈4.3, 3.65和2.01）和520-660 nm附近的圆二色摩尔消光系数（Δε）也都与OP Av1较相似,从而表明ΔnifZ Av1含有与OP Av1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而,ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物（C2H2、H+和N2）的还原活性都较低,分别约为OP Av1的74%和46-50%; 而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OP Av1。此外,与OP Av1相同的ΔnifZ Av1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-taggedΔnifZ Av1（Hu等,2004）的信号明显不同。这就表明,ΔnifZ Av1与OP Av1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态,也不在于P-cluster的结构和氧还状态,而仅在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少（约一半）。据此推测出与国外提出的His-taggedΔnifZ Av1模型不同的ΔnifZ Av1（DJ194）的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和
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中文摘要
ABSTRACT
第一章 前言
1.1 固氮酶的生物化学和生物物理学
1.1.1 固氮酶的结构组成
1.1.1.1 Fe 蛋白
1.1.1.2 MoFe 蛋白
1.1.1.3 铁钼辅因子(FeMoco )
1.1.1.4 P-cluster
1.1.1.5 固氮酶的多样性
1.1.2 固氮酶的特性
1.1.2.1 固氮酶的稳定性与异种两组分的交叉互补性
1.1.2.2 底物的还原特性
1.1.2.3 金属簇的波谱及生化特性
1.1.3 固氮酶的活性调节
1.1.3.1 氨和化合态氮对固氮酶活性的影响
1.1.3.2 ATP 和ADP
1.1.3.3 氧的作用
1.1.3.4 分子伴侣GroEL 蛋白的作用
1.2 固氮酶的分子生物学
1.2.1 固氮酶基因
1.2.2 突变株固氮酶蛋白的研究
1.2.2.1 FeMoco 合成或活性受到影响的突变株
1.2.2.2 P-cluster 特性异常的突变株
1.3 MoFe 蛋白的晶体生长研究
1.4 固氮酶的纯化
1.4.1 常用的主要纯化方法
1.4.1.1 柱层析法
1.4.1.2 超滤结晶纯化
1.4.1.3 亲和层析纯化
1.4.1.4 厌氧制备电泳
1.4.2 几种纯化方法的比较
1.5 选题依据及其研究背景
第二章 材料与方法
2.1 固氮菌的培养
2.1.1 培养基的配制
2.1.2 菌体培养
2.2 固氮酶的纯化
2.2.1 厌氧技术
2.2.1.1 氩气中微量氧的去除
2.2.1.2 厌氧操作要点
2.2.2 固氮酶的分离纯化
2.2.2.1 不同盐浓度的厌氧 Tris-HCl 缓冲液的配制
2.2.2.2 野生种固氮酶MoFe 蛋白(OP Av1)的分离纯化
2.2.2.3 DJ194 固氮酶MoFe 蛋白(ΔnifZ Av1)的分离纯化
2.2.2.4 固氮酶Fe 蛋白(Av2)的分离纯化
2.3 蛋白质浓度及活性测定
2.3.1 用双缩脲法测定蛋白浓度
2.3.1.1 试剂配制
2.3.1.2 标准曲线制作
2.3.1.3 样品蛋白浓度的测定
2.3.2 固氮酶活性测定
2.3.2.1 Mg-ATP 发生系统的配制
2.3.2.2 C_2H_2还原和放氢活性测定
2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫反应
2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.4.1.1 变性凝胶电泳——SDS-PAGE
2.4.1.2 厌氧天然凝胶电泳——anoxic native electrophoresis
2.4.1.3 凝胶成像与扫描
2.4.2 免疫印渍(Western blotting )
2.4.2.1 试剂配制
2.4.2.2 电印渍
2.4.2.3 免疫酶标检测
2.5 波谱分析
2.5.1 质谱测定
2.5.2 圆二色谱测定
2.5.3 电子顺磁共振谱测定
2.6 蛋白金属含量测定
2.7 蛋白质结晶
2.7.1 结晶方法
2.7.2 溶液配制
2.7.3 晶体鉴定
第三章 结果与分析
3.1 高纯ΔnifZ Av1 的制备
3.1.1 ΔnifZ Av1 的纯度及其主要污染蛋白的发现和鉴定
3.1.1.1 主要污染蛋白的发现
3.1.1.2 主要污染蛋白质的鉴定
3.1.2 ΔnifZ Av1 与其主要污染蛋白的分离
3.1.2.1 凝胶柱层析的分步收集
3.1.2.2 Q-Sepharose 柱的梯度洗脱
3.2 ΔnifZ Av1 蛋白金属簇的组成和分布及其与功能的关系
3.2.1 ΔnifZ Av1 的亚基组成
3.2.2 ΔnifZ Av1 的蛋白活性
3.2.3 ΔnifZ Av1 的波谱特性
3.2.3.1 ΔnifZ Av1 的吸收光谱
3.2.3.2 ΔnifZ Av1 的EPR 谱
3.2.3.3 ΔnifZ Av1的CD谱
3.2.4 ΔnifZ Av1 的金属含量
3.2.5 ΔnifZ Av1的推测结构模型
3.3 ΔnifZ Av1 的结晶
3.3.1 ΔnifZ Av1 的结晶条件
3.3.1.1 Hepes 和Tris 对ΔnifZ Av1 制备物晶体生长的影响
3.3.1.2 pH对ΔnifZ Av1晶体生长的影响
3.3.1.3 MgCl_2浓度ΔnifZ Av1 制备物晶体生长的影响
3.3.1.4 PEG 6K 的浓度对ΔnifZ Av1 制备物晶体生长的影响
3.3.1.5 几个生长出质好个大晶体的培养条件
3.3.2 ΔnifZ Av1 的晶体鉴定
第四章 讨论
4.1 固氮酶制备物中几种常见的主要污染蛋白质的分离及鉴定
4.2 nifZ 基因的功能
4.3 ΔnifZ Av1 的结晶研究
小结与创新点
参考文献
发表及待发表论文
缩略语
致谢
发布时间: 2006-04-30
参考文献
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