论文摘要
猪圆环病毒2型（PCV2）是近些年来对养猪业危害最严重的病毒之一。PCV2感染主要引起断奶猪多系统衰竭综合征（ PMWS）、怀孕母猪繁殖障碍（SAMS）、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病（PRDS）、猪皮炎和肾炎综合征（PDNS）、幼龄仔猪A2型先天性震颤（CT）、间质性肺炎（IP）、增生性坏死性肺炎（PNP）等。PCV2感染能降低猪体免疫力,常引起其他病原微生物的继发和并发感染,从而使病情加重。该病在世界许多国家和地区的广泛流行,已经造成了巨大的经济损失,严重影响养猪业的发展。我国很多地区也陆续报道有PCV2流行,甘肃省有PCV2感染疑似病例的发生且有血清学调查的报道,但尚无病原学诊断的证据。为了为PCV2的实验室诊断提供一种可靠的病原学检测方法,本研究在实验室现有研究的基础上,建立了快速检测PCV2的PCR方法,并对PCV2甘肃分离株的遗传变异情况进行了分析,获得结果如下。1.根据GenBank中PCV2全基因组序列设计了扩增片段大小为262 bp的引物P1/P2。为获得该对引物最佳的扩增效果和最高的敏感性,实验对该对引物的扩增条件进行了摸索和调整,即运用正交法,梯度性地改变变性温度和时间、退火温度和时间、延伸时间以及循环数等条件。最后确定了引物对P1/P2的最佳扩增效果,建立了检测PCV2的PCR方法。该引物从PCV2阳性病毒感染基因组中扩增出特异性条带的最低DNA含量为10-6 ng/mL（约100个PCV2病毒）。用该方法对我国甘肃省的75份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测,结果有39份样品为阳性,阳性率为52%。2.根据Gengbank中发表的PCV2的全基因序列,设计一对特异性引物P3/P4。从该省PCV2阳性病料中抽取不同地区的样品6份,从6份阳性病料中直接扩增出PCV2全基因序列,分别命名为Gansu1、Gansu2、Gansu3、Gansu4、Gansu5、Gansu6。将扩增片段克隆入pMD 18-T载体。对质粒中的插入片段进行序列测定表明,Ganshu5的基因组长度为1768bp,其余各株均为1767bp。应用DNAstar序列分析软件,对测定的6个PCV2毒株全基因组序列与Gengbank中PCV毒株进行同源性比较并绘制系统发生树,结果表明,本研究的6个PCV2分离株之间核苷酸序列同源性达97.8%～99.4%;与PCV1毒株的序列同源性只有69.2%～70.3%。其中ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为97.6%～99.1%和89%～99.2%。