牛Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4基因真核表达载体的构建及皮肤成纤维细胞转染

论文摘要

诱导性多潜能干细胞（iPS细胞）是指通过特定的转录因子在体细胞中的异位表达,致使体细胞重编程而产生的细胞,是可不断自我更新和具有多向分化潜能的细胞。成纤维细胞呈梭形或扁的星状,具有突起,是功能活动较旺盛的细胞,但是成纤维细胞具有有限的分裂次数,在转基因实验操作过程中,这种“短暂”的寿命对通过体细胞核移植生产转基因动物有一定的影响,限制了其在科研和实际当中的应用。本研究通过利用牛胎儿组织和早期胚胎克隆出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因,并将目的基因定向克隆到真核表达载体,为下一步以成纤维细胞为靶细胞,运用iPS细胞技术获得在一定培养条件下能保持自我更新能力的类干细胞的研究提供基础,以便于基因打靶、筛选等一些为生产转基因动物所作的前期准备工作的顺利完成。结果如下:1.以牛胎儿原始生殖嵴和囊胚为材料,用RT-PCR方法克隆出牛Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因的开放阅读框序列。利用基因重组技术将目的基因克隆到pMD19-T载体上,转化感受态大肠杆菌（DH5α）,将鉴定出的阳性克隆送测序后,利用在线分析软件Blast分析,证明所得DNA片段为目的基因片段,同源率均达到99%,可以用于后续实验研究。2.以PIRES2-AcGFP1-Nuc载体作为骨架,利用基因重组技术分别构建出目的基因真核表达表达载体。重组载体质粒转染293FT细胞后,用Western blotting检测重组真核表达载体表达,结果表明目的基因片段能够正确编码目的蛋白,可以用于后期诱导实验。3.利用FuGENE HD转染试剂将重组质粒导入牛胎儿成纤维细胞,观察到载体能够有效表达。通过细胞筛选液培养牛胎儿成纤维细胞,发现当细胞筛选液G418的浓度为700μg/mL时,未转染的牛胎儿成纤维细胞在第7天全部死亡,而用pIRES2-AcGFP1-Nuc转染的牛胎儿成纤维细胞存活,因此确定牛胎儿成纤维细胞的G418筛选浓度为700μg/mL,维持浓度为350μg/mL。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 诱导性多潜能干细胞研究概述
• 1.1 胚胎干细胞的多能性与自我更新
• 1.1.1 胚胎干细胞多能性调节有关的转录因子
• 1.1.2 干细胞自我更新与细胞周期调控的关系
• 1.2 iPS 细胞研究概述
• 1.3 细胞核重编程技术概述
• 1.3.1 体细胞核移植
• 1.3.2 细胞融合
• 1.3.3 体细胞与多能性细胞提取物共孵育
• 1.3.4 多能性相关因子介导的细胞核重编程
• 1.4 iPS 细胞相关的转录因子
• 1.4.1 Oct4
• 1.4.2 Sox2
• 1.4.3 c-Myc
• 1.4.4 Klf4
• 1.4.5 其它的转录因子或小分子
• 1.4.6 转录因子之间的相互作用
• 1.5 iPS 细胞的应用及研究意义
• 1.5.1 生产转基因动物
• 1.5.2 复制濒危的动物物种
• 1.5.3 性别控制
• 1.5.4 临床疾病治疗
• 1.5.5 药物筛选
• 1.6 诱导多能干细胞存在的问题与展望
• 实验部分
• 第二章 牛 Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4 基因的克隆与序列分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 牛Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4 基因PCR 扩增结果
• 2.2.2 序列测序比对结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 牛Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4 基因真核表达载体的构建与鉴定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 牛Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4 基因真核表达载体表达的检测
• 3.2.1 重组质粒的纯化
• 3.2.2 重组质粒转染293FT 细胞
• 3.2.3 Western blotting 检测蛋白表达
• 3.3 结果
• 3.3.1 酶切鉴定结果
• 3.3.2 重组质粒分别转染293FT 细胞及其表达结果检测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 牛Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4 基因真核表达载体的转染和筛选
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 重组质粒构建结果
• 4.2.2 重组质粒转染牛成纤维细胞后PCR 检测结果
• 4.2.3 牛胎儿成纤维细胞筛选液的药物筛选浓度
• 4.2.4 牛胎儿成纤维细胞的培养与筛选
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 下一步研究内容
• 参考文献
• 附录
• 英文缩略词表
• 致谢
• 个人简介