大鼠L6骨骼肌成肌细胞移植治疗心肌梗死的实验研究

论文摘要

目的:心肌梗死是造成中老年人死亡的主要原因之一。目前常规的治疗措施如药物治疗、介入治疗等,虽有很好的临床效果,但都不能逆转死亡的心肌细胞。细胞移植治疗能够取代坏死的心肌细胞、增加有收缩功能的细胞数量,从而达到改善心功能的目的,被认为是具有广泛临床应用前景的一种理想治疗手段。目前许多实验都表明骨骼肌成肌细胞是作为细胞移植较为理想的一种供体细胞,但大多数实验都使用原代培养的成肌细胞,本实验应用L6骨骼肌成肌细胞株移植,探讨骨骼肌成肌细胞株移植治疗心肌梗死的可行性及不同数量的移植细胞对心肌梗死大鼠心功能改善的影响,以为今后的研究提供基础实验数据。方法1大鼠L6骨骼肌成肌细胞的培养及标记大鼠L6骨骼肌成肌细胞经复苏后在37℃,5% CO2条件下培养于DMEM培养基（含10%胎牛血清、抗生素）,细胞生长达80%～90%融合时传代。取对数生长期的细胞用含2倍DMEM培养基的胶体金溶液标记20～24小时后,收集细胞、分装,移植备用。HE染色观察细胞形态,透射电镜检查细胞的标记率。2大鼠心肌梗死模型的制备及心梗后不同时间心肌组织病理学变化的观察选健康雄性SD大鼠60只,采用结扎冠状动脉左前降支的方法制作大鼠心肌梗死模型。分别于造模后1天、1周、2周、3周、4周取材,用HE染色、免疫组化的方法观察心肌的组织病理学变化,并用流式细胞仪检测心肌细胞细胞周期的变化。3大鼠L6骨骼肌成肌细胞移植到心肌梗死大鼠体内的生长发育情况95只健康雄性SD大鼠随机分为5组:对照组、1×106移植组、2×106移植组、4×106移植组和1×107移植组。其中对照组15只,其余每组各20只。采用结扎左冠状动脉前降支的方法制作心梗模型,造模后立即注射相应数量的L6骨骼肌成肌细胞至各实验组大鼠心梗区,对照组注射等量的无血清培养基。移植后1周、2周、3周、4周取材,用HE染色、免疫组化、透射电镜和流式细胞仪检测的方法观测移植的细胞在大鼠心梗区内的生长发育情况。移植后4周通过血流动力学的各项指标评价各组大鼠心功能的变化情况。结果1大鼠L6骨骼肌成肌细胞的培养和标记大鼠L6骨骼肌成肌细胞传代培养1天后大部分细胞贴壁并生长,细胞多数为纺锤形,有一到两个椭圆形细胞核,位于细胞中央。细胞增殖旺盛,2天后可达到80%～90%融合。胶体金标记后透射电镜观察细胞质内出现含胶体金颗粒的吞饮泡,标记率达80%以上。2大鼠心肌组织在心梗后不同时间的组织病理学变化心肌梗死后1天,心肌坏死反应显著,以凝固性坏死为主,1周左右心梗区炎症反应强烈,随后梗死的心肌组织开始被胶原组织替代,瘢痕区逐渐扩大,于心梗后4周可形成透壁性心梗,室壁变薄、心室呈球形改变。PCNA免疫组化和流式细胞学结果均显示心梗后早期心梗区周围的正常心肌细胞可以增殖,但是这种能力极为有限,并随时间延长而减弱。3大鼠L6骨骼肌成肌细胞移植到心肌梗死大鼠体内的生长发育状况我们分别用免疫组化、透射电子显微镜、流式细胞仪等手段检测了L6骨骼肌成肌细胞在心肌梗死大鼠体内的生长情况。免疫组化结果显示移植后早期PCNA阳性细胞较多,随时间延长阳性细胞逐渐减少,desmin阳性细胞在移植后2周较多见,Cx43以及转录因子GATA-4在移植后各阶段均未见表达。上述结果提示L6骨骼肌成肌细胞可以在大鼠心梗区存活并有较强的增殖能力,部分移植细胞可分化成肌管,但是移植细胞未与宿主的心肌细胞形成通讯连接且未向心肌细胞分化。移植后4周心功能测定结果显示2×106移植组大鼠的LVSP、LVEDP、LVdp/dt和LV-dp/dt相对于对照组及1×106移植组的上述指标均有显著差异,1×106移植组和对照组的上述指标相比无显著差异。这一结果提示移植细胞的数量越多对心功能的改善作用越明显,但是也不是无限制的越多越好。我们的实验发现4×106和1×107移植组的大鼠移植部位及其附近出现瘤样增生,取材后检测光镜下移植细胞呈旺盛增生表现,核染色深、核分裂相多见,但未见异常核分裂相。细胞排列密集,呈团状或束状分布,并向周围组织浸润生长。透射电镜观察移植细胞内未见胶体金颗粒,胞质内未见肌丝样结构,细胞核较大,核浆比大于1:3,某些细胞核异型性明显。流式细胞仪检测细胞DNA指数DI=1.31±0.14,与正常对照组（DI=1.00±0.11）相比有显著差异,提示过量的移植细胞有致瘤倾向。结论1用结扎左冠状动脉前降支的方法建立的大鼠心肌梗死动物模型,心梗后心肌组织病理学变化与临床表现相近,且造模成功率高,是研究心肌修复的良好模型。2心肌梗死后残存的正常心肌细胞有一定的增殖能力。3本实验采用胶体金标记大鼠L6骨骼肌成肌细胞,虽然体外标记率较理想,但移植后光镜和电镜下不易识别,仍需探索更适宜的移植细胞标记方法。4大鼠L6骨骼肌成肌细胞移植入大鼠心梗区后可以存活、分化,其增殖能力较强,分化能力较弱。5 2×106的大鼠L6骨骼肌成肌细胞比1×106有更好的改善心功能的效果。6过量的大鼠L6骨骼肌成肌细胞可以在宿主体内不断增殖,破坏正常的组织结构,存在致瘤性危险。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 大鼠L6骨骼肌成肌细胞移植治疗心肌梗死的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 骨骼肌成肌细胞移植治疗心肌梗死的研究进展
• 致谢
• 个人简历