大肠癌干细胞耐药、抗凋亡特性及其缺氧微环境的相关研究

论文摘要

研究背景与目的肿瘤干细胞理论表明,肿瘤组织中存在着一小部分具有特殊功能的肿瘤干细胞,它们具有不断的自我更新能力和一定的多向分化潜能,表现出干细胞特性,在动物移植瘤实验中又具有极强的致瘤性并分化构成肿瘤组织的各个组成部分。目前,已在多种实体肿瘤中发现肿瘤干细胞的存在,肿瘤干细胞鉴定和分选主要通过标记其特异性表面标志,经免疫磁珠活性分选（MACS）和流式荧光激活细胞分选（FACS）得到。此外,通过特异性外排染料Hochest33342特性分选的侧群细胞（Side Population, SP）同样具有干细胞特性,也成为分选肿瘤干细胞的一种方法。随着肿瘤干细胞研究的深入,肿瘤被视为一种干细胞疾病被广泛接受。肿瘤的难治和复发一直是困扰临床治疗较为棘手的问题,因为肿瘤干细胞理论的提出,因此,针对临床肿瘤治疗困难的问题,研究越来越多的集中在参与肿瘤起始的肿瘤干细胞和肿瘤干细胞相关微环境。大量研究表明,肿瘤干细胞的生物学特性影响着肿瘤治疗效果,首先,肿瘤干细胞处于细胞生长周期的G0期,即静止期,而多数化疗药物只能作用于处于增殖期的肿瘤细胞；其次,它所具有的自我更新和未分化的特性是受肿瘤间质细胞、血管内皮细胞及其相关微环境共同维持和调控的,同时它高表达耐药蛋白,具有极强的DNA损伤后修复能力,因而具备抵抗放化疗的特性。目前,对于大肠癌干细胞在细胞株中的研究并不多,因而本实验集中在大肠癌细胞株耐药、抗凋亡的生物学特性及其可能机制的探究。此外,对于肿瘤干细胞相关微环境的研究认为,肿瘤组织因过快生长、肿瘤内部血管分布不均,使部分肿瘤细胞和肿瘤干细胞存在于缺血、缺氧的微环境中,这一微环境也使肿瘤细胞和肿瘤干细胞的生物学特性发生某些改变,这些也可能导致肿瘤耐药、转移和复发。而氯化钴（CoCl2）在体外能够模拟细胞缺氧,阻止HIF-1α被羟化等机制引起一系列细胞对缺氧的反应,检测HIF-1α蛋白的表达量可以反映细胞的缺氧程度。因而本实验以体外模拟细胞缺氧为起点,开展围绕大肠癌细胞和大肠癌干细胞缺氧的更广泛研究。本实验选取一株人结肠癌细胞株SW480,以结肠癌干细胞公认的表面标志CD133为分选标志,免疫磁珠分选SW480中CD133+SW480干细胞亚群,并以普通SW480细胞为对照,研究这两群细胞在体外对临床常用化疗药物作用的敏感性,同时体外模拟肿瘤细胞缺氧微环境,研究普通肿瘤细胞和肿瘤干细胞在缺氧微环境中生物学特性的改变及其差异,及肿瘤微环境对肿瘤细胞表面标志、侵袭转移、抗凋亡相关基因表达的作用,以期为大肠癌及大肠癌干细胞的研究和治疗奠定基础。材料和方法1.结肠癌细胞的培养和免疫磁珠分选结肠癌细胞SW480培养于含10%胎牛血清、含1×105U/L青-链霉素的RPMI1640培养基,在37℃、5% C02孵箱中培养,以2.5%胰酶消化传代；将处于对数生长期SW480细胞,消化离心收集,重悬细胞于分选缓冲液并计数,加入FcR阻滞剂、CD133免疫微磁珠避光孵育,洗涤后分选缓冲液重悬细胞；向MS柱内加入已处理的细胞悬液,收集未标记细胞,分次过柱后,向柱中加入分选缓冲液,活塞迅速推入得到标记细胞。2.CCK-8细胞毒性试验接种处理好的单细胞悬液于96孔板,每孔90μl培养基含5×103细胞,每组设5个复孔,而后加入化疗药物氟尿嘧啶、奥沙利铂分别调整为四个浓度梯度各10μl,处理24小时后,以无药物处理组为对照,各孔加入CCK-8溶液10μl,继续培养2h后在450nm波长下,酶标仪检测各孔光吸收值,记录结果,以浓度为横轴,细胞生长抑制率为纵轴绘制两种细胞曲线,实验重复三次,数据以均数±标准差表示。3.流式细胞术检测细胞凋亡将CD133+SW480和SW480以1×106细胞/孔接种于6cm培养皿,接种后分别以氟尿嘧啶和奥沙利铂的IC20加入各个培养皿中以诱导凋亡,作用24h后收集并洗涤1-5×105细胞,加入195μl Annexin V-FITC结合液,然后加入5μlAnnexin V-FITC,室温避光孵育10min,1000g离心5min,弃上清加入190μlAnnexin V-FITC结合液,再加入10μlPI染色液,冰浴避光放置,流式细胞仪检测细胞凋亡比例。4.CoCl2体外模拟细胞缺氧用无血清培养基配制浓度为100mmol/L CoCl2母液,根据实验需要分别稀释成不同浓度50、100、150、200、250μmol/L,加入SW480细胞/CD133+SW480干细胞亚群的6cm培养皿中以模拟细胞缺氧。5. SYBR green实时荧光定量PCR根据实验要求和设计,TriZol法提取将氯化钴模拟缺氧后的SW480细胞和普通SW480细胞的RNA,分光光度计测定RNA纯度和浓度,使用逆转录试剂盒将纯度在1.8-2.0的500ng RNA逆转录为cDNA,以相应基因上下游引物、cDNA模板、酶、SYBR、ROX组成的反应体系,ABI 7500实时荧光定量PCR仪采集PCR反应时荧光信号,stage 1（预变性）：95℃30sec, stage 2（PCR反应）：95℃5sec、60℃34sec共反应40个循环,结果由Ct值换算得出。6. Western blotting根据实验要求和设计预先将细胞分组并做不同处理,将处理后的细胞提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,按《分子克隆》第三版配方配制10%蛋白电泳分离胶和5%积层胶,蛋白变性上样,上样量30μg,恒压110V电泳30min、恒压70V电泳2h,300mA 1-2h恒流湿电转膜,5%脱脂奶粉/TBS-T室温封闭1h,5%脱脂奶粉/TBS-T 1：500-1000稀释相应的一抗,与PVDF膜4℃孵育过夜,TBS-T洗涤,同样方法1：2000-5000稀释HRP标记二抗,室温1-2h,TBS-T洗涤后,Carestream凝胶成像仪检测,Image J软件分析灰度值。7.统计学分析数据采用SPSS 13.0统计软件分析,免疫磁珠分选所得阳性细胞比例、CCK-8细胞毒性试验细胞生长抑制率、流式细胞术检测早期凋亡细胞比例等实验结果取三次以上结果的平均值；western blotting结果行灰度扫描后进行统计,实时荧光定量PCR结果以对照组基因表达量为基数1,实验组根据Ct值换算成对照组的相对倍数进行统计分析；参数比较前进行Levene’s方差齐性检验,在满足方差齐性的基础上进行独立样本t检验；多组间比较采用One-Way ANOVA,满足方差齐性时采用LSD法,方差不齐时,采用Brown-Forsythe或Welch近似方差分析；实验结果用均数±标准差表示,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果1.CD133免疫磁珠细胞分选可得到较高比例的阳性细胞：经免疫磁珠分选SW480细胞所得CD133+SW480干细胞亚群中,CD133表达阳性的细胞比例为85.56±0.89%；2.在相同浓度氟尿嘧啶和奥沙利铂分别作用于CD133+ SW480干细胞亚群和普通SW480细胞时,CD133+ SW480干细胞亚群细胞生长抑制率低于普通SW480细胞,差异有统计学意义（P<0.05）;3.经一定相同浓度氟尿嘧啶和奥沙利铂分别作用于CD133+SW480干细胞亚群和普通SW480细胞诱导凋亡后,两者早期凋亡细胞比例的差异有统计学意义（P<0.05）；4.CoCl2体外模拟细胞缺氧HIF-1α蛋白的表达具有时间和浓度依赖性,在200μmol/L作用于SW480细胞8h,HIF-1α蛋白表达量最高,模拟缺氧效应最佳（P<0.05）；5.在缺氧培养条件下,CD133+SW480干细胞亚群形成细胞球的比例高于正常培养条件,两种培养条件下细胞球形成率有差异；6.经CoCl2体外模拟细胞缺氧的最佳浓度和时间模拟CD133+ SW480干细胞亚群和普通SW480细胞缺氧,后者HIF-1α蛋白表达量高于前者,两者HIF-1α蛋白表达量的差异有统计学意义（P<0.05）；7.经CoCl2体外模拟SW480细胞缺氧后,其PROM1、survivin和VEGF基因mRNA水平的表达高于正常培养条件的细胞,两组差异有统计学意义（P<0.05）。结论免疫磁珠分选是肿瘤干细胞分选的一种较好方法,其分选细胞具有污染率低、所得阳性细胞比例高、操作简捷、对细胞活力影响较小的优点,本实验经免疫磁珠分选得到CD133+SW480干细胞亚群,通过体外CCK-8细胞毒性试验、Annexin V-FITC/PI凋亡检测,其耐药和抗凋亡的特性得以证实,推测CD133+SW480干细胞亚群耐药和抗凋亡特性的产生可能与其高表达的某些药物外排、凋亡抑制基因有关。CoCl2在体外能够很好的模拟细胞缺氧,在最适浓度和作用时间能够使细胞HIF-1α蛋白最大量表达,且对比在模拟缺氧环境条件下和正常培养条件下,CD133+SW480干细胞亚群在无血清的条件培养基中,缺氧条件下细胞球形成率高于在正常培养条件下；通过荧光实时定量PCR对经模拟缺氧的SW480细胞干细胞基因PROM1进行检测,发现其在模拟缺氧后表达升高,推测缺氧可能参与普通肿瘤细胞向肿瘤干细胞的转化；此外,以COCl2模拟缺氧的最适浓度和时间模拟CD133+SW480干细胞亚群和普通SW480细胞缺氧后,经western blotting检测,HIF-1α蛋白在CD133+SW480干细胞亚群的表达量较普通SW480细胞表达量低,间接反映CD133+SW480干细胞亚群对缺氧环境不甚敏感这一有别于普通肿瘤细胞SW480的特性；最后,模拟缺氧的SW480细胞其抗凋亡基因survivin、肿瘤侵袭转移相关的基因VEGF表达均升高,推测缺氧微环境与肿瘤耐药、抗凋亡、侵袭转移和复发有着不可分割的联系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 大肠癌干细胞耐药和抗凋亡特性的研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 小结
• 第二章 大肠癌细胞和大肠癌干细胞缺氧微环境的研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 小结
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 中英文缩略词对照表
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢
• 统计学证明