论文摘要
目的:建立SELEX技术体外筛选胃癌细胞SGC-7901适配子的方法,以获得能与SGC-7901细胞特异性结合的适配子。测定适配子与胃癌细胞的结合活性,以确定其亲和性及特异性,为应用于胃癌的临床诊断和治疗奠定基础。方法:依据相关文献,体外合成两端各为18个碱基固定序列、中间为52个碱基随机序列、全长88个碱基的ssDNA文库,以胃癌细胞SGC-7901为靶细胞、人胃粘膜细胞GES-1为反筛细胞,通过直接以活细胞做为筛选介质,优化PCR扩增技术,采用生物素-链亲和素磁珠分离法制备ssDNA次级文库,建立了更加简便的SELEX技术,筛选出针对胃癌细胞SGC-7901高亲和力高特异性的适配子。利用地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统测定每轮ssDNA文库与胃癌细胞的亲和力。将最后一轮筛选产物进行克隆、测序并用相关软件进行适配子序列一级和二级结构分析。进一步检测克隆适配子与胃癌细胞的亲和性,选出一条亲和性最高的适配子,分别与胃癌细胞SGC-7901、人胃粘膜细胞GES-1进行结合反应,以确定其特异性。结果:1.不同的退火温度和不同的循环次数将会产生不同的PCR扩增效率,通过PCR条件优化,在退火温度为45℃、15个循环时扩增dsDNA产物最理想。2.经过12轮SELEX筛选,针对SGC-7901细胞的特异性适配子达到较大程度的富集,结合实验显示,每轮ssDNA文库与SGC-7901细胞结合的A值由第1轮的0.16上升到第12轮的1.14,第10轮后A值基本保持稳定,表明ssDNA与细胞的结合亲和力达到饱和。3.采用生物素-链亲和素磁珠分离法制备的ssDNA次级文库较稳定,12轮筛选均可得到足量和高纯度的ssDNA文库。4.21个克隆子测序,有2个适配子序列中间随机区缺失一个碱基。另外19个序列均全长88 bp,其中有4个序列完全一致。二级结构预测茎环可能是适配子与胃癌细胞特异性结合的结构基础。5.结合实验显示,C516适配子与SGC-7901细胞结合的A值最高,为1.228,C517适配子与SGC-7901细胞结合的A值最低,为0.645。测得C516适配子与SGC-7901细胞和GES-1细胞结合的A值分别为1.228和0.239。结论:利用随机单链寡核苷酸文库成功建立起SELEX筛选技术,获得了针对胃癌细胞SGC-7901的适配子,初步确定了筛选出的适配子具有较高的亲和力和较强的特异性。为进一步运用适配子早期诊断和治疗胃癌奠定了基础。
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