γ-谷氨酰转肽酶的纯化和性质及其用于L-茶氨酸的生物制备研究

论文摘要

L-茶氨酸是存在于茶叶内的一种主要氨基酸,是一种具有多种生理功能且不会产生任何副作用的一种功能因子,在食品、保健和医疗领域中具有重要的应用价值。因此,研究生物法合成L-茶氨酸具有重要的现实意义。目前生物法生产L-茶氨酸最有效的酶是γ-谷氨酰转肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase, GGT, EC 2.3.2.2）。GGT是生物体内谷胱甘肽代谢途径中的关键酶,也是催化转移L-γ-谷氨酰基的特异性酶,可催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸（γ-谷氨酰基-乙胺）,在催化合成方面正成为研究者关注的热点。本研究首先从发酵食品虾酱中通过发酵法产GGT实验和酶法合成L-茶氨酸实验两步筛选法分离得到一株可用来高效合成L-茶氨酸的菌株SK11.004。通过形态观察和生理生化特性实验,结合16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌,并将其命名为Bacillus subtilis SK11.004。其16S rDNA基因全长为1142 bp,已提交至GenBank数据库,数据库登记号为:FJ437210。GGT的合成与菌体生长同步,发酵16 h产酶活力最高,达到2.5 U/mL。在筛选获得Bacillus subtilis SK11.004的基础上,建立了以L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物通过发酵液酶促反应合成L-茶氨酸的工艺,并完成了中试生产。首先对酶促反应条件进行了优化,在最适反应条件下,副反应得到了有效的抑制,L-茶氨酸的转化率约为94%,纯度达65.2%。此外,还建立了L-茶氨酸的脱色及分离纯化工艺,通过串联使用阴阳离子交换树脂去除反应液中的L-谷氨酸及其它杂质,再经洗脱、减压浓缩干燥,获得L-茶氨酸,纯度达到85%,收率为80.4%。最后建立了L-茶氨酸的结晶工艺,在优化后的结晶工艺条件下,晶体得率为48%,晶体纯度达97%,并利用扫描电镜对其晶体形态进行了扫描,晶体呈规则的致密的方形层状结构。对B. subtilis SK11.004的发酵液进行了分离纯化,采用超滤、硫酸铵沉淀、疏水作用层析和凝胶过滤等手段,得到两种具有GGT活力的酶（GGT-1与GGT-2）,比酶活分别达到684.9和193 U/mg。通过Native-PAGE、SDS-PAGE和凝胶过滤色谱对酶的纯度和分子量进行测定,结果表明GGT-1为二聚体,包含两个亚基（40 kDa和21 kDa）,分子量约为62 kDa;GGT-2为单体酶,分子量约为58 kDa。对比酶活高的GGT-1的酶学性质进行了系统研究。其转肽反应的最适pH为10;水解反应的最适pH为8.0;在pH6-12的缓冲液中酶活稳定性良好;等电点为7.8,说明该酶处于兼性离子及负离子时,才能更好地发挥活力;该酶的最适反应温度为37 oC,在50 oC以下具有良好的稳定性;Na+和Ca2+对酶活影响不明显,Al3+和Mg2+能促进酶活力,Cu2+和Zn2+对GGT的酶活有明显抑制作用,Zn2+的抑制作用最强,可抑制32.2%的活力,而酸根离子SO42-、Cl-、NO3-对酶活基本没有影响。另外,EDTA对酶活基本没有影响,说明GGT-1并非金属蛋白酶。对GGT-1的底物特异性进行研究,结果说明,空间位阻的大小、氨基酸的酸碱性是影响活力的最主要因素,侧链的增加以及酸性的增强会导致酶与底物亲和力的下降,且空间位阻的影响要大于酸碱性的影响。此外,底物的立体异构性对于酶的转肽活力也有一定影响。GGT-1对于谷氨酰供体具有相对低的Km值,而对于谷氨酰受体则具有高的Km值。对于γ-GpNA具有低的亲和力,而对于L-Gln亲和力高一些。L-Gln转肽反应和水解反应的特征常数Km分别为0.83和3.16 mM,说明GGT-1易于催化L-Gln进行转肽反应。该酶催化反应速率较快,催化效率较高,可用于γ-谷氨酰类化合物的的生物转化。化学修饰剂PMSF和NBS对酶蛋白的活性影响显著,表明羟基和色氨酸残基均是GGT-1酶活性功能的必需基团。添加底物对NBS对酶的修饰不起保护作用,说明被修饰的色氨酸残基可能不处在酶与底物的契合部位,但它是维持酶空间结构保持其活性必需的基团,而底物的添加对PMSF对酶的修饰有一定保护作用,表明羟基处于底物结合区域。圆二色谱进一步考察了经PMSF和NBS修饰后GGT-1二级结构的变化。结果表明,GGT-1的二级结构由34.4%α-螺旋、11.7%β-折叠、22.2%转角和31.7%无规卷曲组成。经5 mmol/L PMSF处理1h后,其α-螺旋含量由34.4%减少至23.1%,β-折叠和无规卷曲的含量分别增加至17.6%和42.2%,而β-转角的含量则下降至17.1%,说明酶蛋白的二级结构受到了一定程度的破坏。而GGT被1mmol/L NBS修饰后,仅剩余6.8%的α-螺旋,其余结构均转变成了无规卷曲,基本失去了蛋白结构特征,进一步证实了色氨酸残基对于维持酶空间结构的重要性。对GGT-1进行了质谱鉴定,经数据库检索,获得一个Mascot score达到84的有效匹配,匹配蛋白为来自Bacillus amyloliquefaciens FZB42的GGT,氨基酸覆盖率达18%,初步判断GGT-1为γ-谷氨酰转肽酶。经492cLC型蛋白质测序仪分析,GGT-1大亚基的N端结构前八个氨基酸残基连接依次为:FSYDTYKQ。与通过肽指纹图谱匹配到的蛋白质比对,基本与其第35个氨基酸至第43个氨基酸吻合。证实肽指纹图谱鉴定的准确性。结合肽指纹图谱和N端测序结果,确证GGT-1是一种新的γ-谷氨酰转肽酶,且与B. amyloliquefaciens FZB42 GGT具有较近的同源性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 L-茶氨酸
• 1.1.1 L-茶氨酸的分布
• 1.1.2 L-茶氨酸的理化性质
• 1.1.3 L-茶氨酸在茶树体内的代谢
• 1.1.4 L-茶氨酸在人体内的代谢
• 1.2 L-茶氨酸的生理功能和应用前景
• 1.2.1 L-茶氨酸的生理功能
• 1.2.2 L-茶氨酸的应用前景
• 1.3 工业化生产L-茶氨酸的可能途径
• 1.3.1 提取分离法
• 1.3.2 化学合成法
• 1.3.3 植物组织或细胞培养法生产L-茶氨酸
• 1.3.4 微生物酶法生产L-茶氨酸
• 1.4 γ-谷氨酰转肽酶的研究进展
• 1.4.1 γ-谷氨酰转肽酶的微生物来源
• 1.4.2 GGT 的性质
• 1.4.3 在催化合成上的应用
• 1.5 本课题的立题依据和意义
• 1.6 本课题研究思路与主要内容
• 参考文献
• 第二章 γ-谷氨酰转肽酶产生菌种的分离、筛选及鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 菌种来源
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 菌种筛选
• 2.2.6 菌种鉴定
• 2.2.7 GGT 酶活力的测定
• 2.2.8 L-茶氨酸含量的测定
• 2.2.9 菌体生长浊度的测定
• 2.2.10 遗传稳定实验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 菌种的筛选
• 2.3.2 菌种鉴定
• 2.3.3 遗传稳定研究试验
• 2.3.4 B. subtilis SK11.004 发酵生产GGT 的过程曲线
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 酶法生产L-茶氨酸的工艺研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 GGT 转肽活力测定方法
• 3.2.4 L-茶氨酸含量的测定方法
• 3.2.5 粗酶液的制备
• 3.2.6 酶反应条件的优化
• 3.2.7 L-茶氨酸原料液的脱色处理
• 3.2.8 离子交换树脂分离纯化L-茶氨酸
• 3.2.9 L-茶氨酸的结晶
• 3.2.10 L-茶氨酸的鉴定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 酶法合成最佳反应条件
• 3.3.2 L-茶氨酸料液的脱色处理
• 3.3.3 L-茶氨酸的分离纯化
• 3.3.4 L-茶氨酸的结晶
• 3.3.5 L-茶氨酸的鉴定
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 γ-谷氨酰转肽酶的分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 主要实验材料
• 4.2.3 主要实验仪器
• 4.2.4 粗酶液的制备
• 4.2.5 超滤
• 4.2.6 硫酸铵分级沉淀
• 4.2.7 HiprepTM phenyl FF（high sub） 16/10 疏水层析
• 4.2.8 Superdex 75 HiLoad 10/300 prep grade 凝胶过滤层析
• 4.2.9 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）鉴定
• 4.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
• 4.2.11 酶液中蛋白质含量的测定
• 4.2.12 GGT 活力测定方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 硫酸铵分级沉淀
• 4.3.2 HiprepTM phenyl FF（high sub） 16/10 疏水层析
• 4.3.3 Superdex 75 HiLoad 10/300 prep grade 凝胶过滤层析
• 4.3.4 Superdex 75 凝胶色谱确定GGT 分子量
• 4.3.5 纯化结果及SDS-PAGE 电泳鉴定
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 γ-谷氨酰转肽酶的性质研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 主要实验仪器
• 5.2.3 GGT-1 转肽活力测定方法
• 5.2.4 GGT-1 水解活力测定方法
• 5.2.5 蛋白质含量的测定方法
• 5.2.6 L-谷氨酰胺，L-谷氨酸与L-茶氨酸的检测方法
• 5.2.7 温度对酶活及热稳定性的影响
• 5.2.8 pH 对酶活的影响
• 5.2.9 金属离子对酶活的影响
• 5.2.10 底物专一性
• 5.2.11 反应动力学常数的测定
• 5.2.12 等电点的测定
• 5.2.13 化学修饰剂对酶活的影响
• 5.2.14 GGT-1 的圆二色谱
• 5.2.15 GGT-1 的质谱鉴定
• 5.2.16 N 端结构测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 pH 对酶活及稳定性的影响
• 5.3.2 温度对酶活及热稳定性的影响
• 5.3.3 金属离子对酶活的影响
• 5.3.4 GGT-1 的底物特异性研究
• 5.3.5 GGT-1 的反应动力学常数
• 5.3.6 GGT-1 的等电点的测定
• 5.3.7 GGT-1 活性功能的必需基团的研究
• 5.3.8 化学修饰剂对GGT-1 二级结构的影响
• 5.3.9 GGT-1 的质谱鉴定
• 5.3.10 GGT-1 的N 端结构测定
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 论文主要结论
• 论文创新点
• 致谢
• 附录1：N-端结构分析图谱及标准氨基酸分析图谱
• 附录2：GGT-1 电喷雾质谱ESI-MS 分析质量肽谱
• 作者在攻读博士学位期间发表的论文