扫描电化学显微镜细胞双信息成像研究

论文摘要

前言首先对扫描电化学显微镜（SECM）的实验装置和工作模式进行了简要的介绍。然后就SECM的下述两个方面进行了较详细的介绍。1.介绍了SECM探头的发展。2.介绍了SECM在细胞和酶分析方面的应用。 第一章制作了双金微米电极,对其进行了表征,并与单根金微米电极的表征结果进行了比较,结果显示两者无显著性差异。并将此电极用作SECM的探头分别作了向导体基底和绝缘体基底的探头逼近曲线,与理论曲线拟合后基本重合,说明我们做的双电极能用作SECM实验中。 第二章用扫描电化学显微镜同时成像单个活细胞内的过氧化物酶活性和细胞形貌。首先,用SECM的收集模式确定了测定PO的最佳条件。又利用毛地黄皂苷（Dig）能溶解细胞膜上的胆固醇的性质,在细胞膜上产生微孔。细胞内的大分子（如酶）仍然被禁锢在细胞内部,而小分子物质（如酶的底物和产物）则可以进出细胞。经过Dig处理后的细胞仍能存活。当溶液中加入PO的底物（H2Q和H2O2）后,它们可以扩散到细胞内,并在细胞内PO的催化下反应生成BQ和水。将双电极探头的一支电极的电位恒定于BQ发生还原反应的电位,用SECM就可以测得细胞周围BQ在探头上产生的电流,获得细胞表面BQ浓度分布的形貌图。同时溶液中加入K4Fe（CN）6,将另一根电极的电位恒定于K4Fe（CN）6发生氧化反应的电位,当探头扫过细胞时,由于细胞有一定的高度,所以K4Fe（CN）6的氧化电流会有所降低（此时细胞相当于一个绝缘体基底）,从而测得了细胞的形貌。 第三章用SECM同时测得了单个鼠肝细胞中的碱性磷酸酶（ALP）和细胞的呼吸活性。首先用收集模式确定了检测ALP的最佳条件。用毛地黄皂苷（Dig）对细胞进行穿孔。然后加入酶的底物（PAPP）,在ALP的催化水解下生成PAP。将双电极探头的金电极电位恒定于PAP发生氧化反应的电位,用SECM就可以测得细胞周围PAP在探头上产生的电流,从而测得细胞内ALP的活性。同时固定另一根电极（铂电极）的电位为O2发生还原反应的电位,由于细胞呼吸要消耗氧,所以细胞周围O2的浓度要比本体溶液的低,由此我们就可以通过测定细胞周围O2浓度的变化而引起的探头电流的变化来获得细胞的呼吸活性信息。

论文目录

• 符号与缩写
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 扫描电化学显微镜简介
• 2 实验装置
• 3 工作模式
• 4 SECM探头简介
• 5 SECM在细胞方面的应用
• 6 参考文献
• 第一章 双电极的制作与表征
• 1.1 引言
• 1.2 实验部分
• 1.2.1 实验仪器
• 1.2.2 材料、试剂及溶液
• 1.2.3 实验过程
• 1.2.3.1 双金微米电极的制作
• 1.2.3.2 循环伏安法及电极半径的测定
• 1.2.3.3 探头分别向导体基底和绝缘体基底逼近的探头逼近曲线
• 1.3 结果和讨论
• 1.3.1 双金微米电极DP70图
• 1.3.2 双金微米电极的扫描电子显微镜（SEM）图
• 1.3.3 双金微米电极表征结果与单根金微米电极表征结果的比较
• 3Fe（CN）₆溶液中的循环伏安曲线及电极半径的测定'>1.3.3.1 电极在K₃Fe（CN）₆溶液中的循环伏安曲线及电极半径的测定
• 1.3.3.2 电极向绝缘体基底和导体基底逼近的SECM探头逼近曲线
• 1.3.4 双微米电极双电极之间的相互干扰性测定
• 1.3.4.1 测定一根电极收集另一根电极的反应产物的收集效率
• 1.3.4.2 改变一根电极上的电压，观洲另一根电极的循环伏安曲线的变化
• 1.4 结论
• 1.5 参考文献
• 第二章 扫描电化学显微镜同时成像单个活细胞内的过氧化物酶活性和细胞形貌
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 材料、试剂及溶液
• 2.2.3 金／金双微米电极的制备
• 2.2.4 微量加样器的制作
• 2.2.5 高压灭菌
• 2.2.6 玻片硅烷化及HRP的固定
• 2.2.7 中性粒细胞的提取
• 2.2.8 梯度离心法提取后细胞的纯度和成活率
• 2.2.9 细胞的固定及穿孔
• 2Q和K₄Fe（CN）₆在双金电极上的循环伏安响应'>2.2.10 BQ、H₂Q和K₄Fe（CN）₆在双金电极上的循环伏安响应
• 2.2.11 SECM探头Z轴渐进曲线和X-Y轴探头扫描曲线
• 2.2.12 细胞内PO活性和细胞形貌的SECM图像
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 探头的选择
• 2.3.2 双金微米电极探头半径的测定
• 2Q和K₄Fe（CN）₆在双金电极上的循环伏安响应'>2.3.3 BQ、H₂Q和K₄Fe（CN）₆在双金电极上的循环伏安响应
• 2.3.4 双金电极测定中性粒细胞中PO活性和细胞形貌的最佳条件
• 2.3.4.1 探头电位的选择
• 2.3.4.2 最佳浓度的选择
• 2.3.5 不同浓度的细胞穿孔剂Dig对细胞内PO活性的影响
• 4Fe（CN）₆存在下细胞呼吸活性的变化'>2.3.6 K₄Fe（CN）₆存在下细胞呼吸活性的变化
• 2Q中的探头逼近曲线'>2.3.7 金双微米电极在H₂Q中的探头逼近曲线
• 2.3.8 双金电极同时测定中性粒细胞内PO活性和细胞形貌
• 2.3.9 同时得到的细胞内PO活性和细胞形貌的SECM图（灰度图）
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 第三章 SECM同时检测鼠肝细胞中的碱性磷酸酶和细胞的呼吸活性
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 材料、试剂及溶液
• 3.2.3 实验过程
• 3.2.3.1 ALP的固定
• 3.2.3.2 鼠肝细胞的捉取
• 3.2.3.3 细胞的固定及穿孔
• 3.2.3.4 SECM探头Z轴渐进曲线和X-Y轴探头扫描曲线
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 多种酚类在金电极上的循环伏安特性
• 3.3.2 电极的选择
• 3.3.3 金／铂双微米电极半径的测定
• 3.3.4 最佳电位的选择
• 3.3.5 最佳浓度的选择
• 3.3.6 金／铂双微米电极在PAPP溶液中的探头逼近曲线
• 2的浓度变化曲线'>3.3.7 金／铂双电极探头同时扫描得到的细胞周围PAP的浓度变化曲线和O₂的浓度变化曲线
• 3.4 结论
• 3.5 参考文献
• 致谢