HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立

论文摘要

丙型肝炎病毒（HCV）感染已成为全球性的公共卫生问题,目前尚无特效药物。通过测定酶分子的活性来筛选抑制剂药物是一种新型的研究方法。由于候选药物最好可在细胞内发挥作用,因此,建立一种细胞水平上的酶活性检测系统,对于高通量筛选抗HCV药物意义重大。HCV NS3丝氨酸蛋白酶是开发抗HCV药物的常用靶点。基于此,本文初步建立了一种细胞水平的NS3丝氨酸蛋白酶活性检测方法,为进一步高通量筛选抑制剂药物做准备。本实验选择了E.coli和HeLa细胞两种模型。在原核系统中,通过质粒共转化,实现两个蛋白的共表达。在真核系统中,通过引入F2A多肽序列,将两个目的基因串联起来,瞬时转染细胞实现两个蛋白的共表达。首先,确定报告基因。在EGFP的172-173aa处插入NS5A/5B序列,记作EGFP5AB。在原核和真核系统中,实现EGFP5AB的单独表达,EGFP的N末端（1-172aa）和C末端（173-238aa）片段的共表达。荧光显微镜下观察,EGFP5AB单独表达时有绿色荧光,而EGFP的N末端和C末端片段共表达时无绿色荧光。因此原核和真核系统中,EGFP5AB均可作为报告基因。接下来,检测NS3丝氨酸蛋白酶的活性。在原核和真核系统中,分别实现NS3/4A和EGFP,NS3/4A和EGFP5AB的共表达。结果显示,NS3/4A和EGFP共表达时有绿色荧光;而NS3/4A和EGFP5AB共表达时无绿色荧光。说明NS3丝氨酸蛋白酶特异性切割了NS5A/5B位点。由此可见,报告分子的绿色荧光情况能反映NS3丝氨酸蛋白酶的活性,这为今后进一步筛选NS3蛋白酶抑制剂奠定了基础。

论文目录

• 内容提要
• 第1章 绪论
• 1.1 HCV 的概况
• 1.1.1 HCV 的危害
• 1.1.2 HCV 的结构特点
• 1.1.3 HCV NS3 丝氨酸蛋白酶的特点
• 1.1.4 抗HCV 治疗的现状
• 1.2 筛选NS3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的现状
• 1.2.1 筛选NS3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法
• 1.2.2 筛选NS3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞模型
• 1.3 报告基因的选择
• 1.3.1 GFP 的结构特点
• 1.3.2 GFP 的特殊位点
• 1.3.3 报告基因的要求
• 1.4 本课题的实验目的、意义和研究策略
• 1.4.1 实验目的和意义
• 1.4.2 研究策略
• 1.4.3 技术路线
• 第2章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和载体
• 2.1.2 细胞系和细胞培养基
• 2.1.3 工具酶，试剂（盒）
• 2.1.4 试剂的配制
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 提取质粒DNA
• 2.3.2 质粒载体的双酶切处理
• 2.3.3 切胶回收DNA
• 2.3.4 普通PCR 反应体系和条件
• 2.3.5 重叠PCR 反应体系和条件
• 2.3.6 DNA 片段的双酶切处理
• 2.3.7 纯化PCR 产物及酶切产物
• 2.3.8 连接反应
• 2.3.9 质粒DNA 转化感受态细胞
• 2.3.10 菌落PCR 鉴定阳性克隆
• 2.3.11 感受态细胞的制备
• 2.3.12 共转化的实现
• 2.3.13 蛋白质的诱导表达
• 2.3.14 SDS-PAGE 电泳
• 2.3.15 制片观察
• 2.3.17 细胞计数
• 2.3.18 转染观察
• 第3章 原核系统中报告质粒的确定
• 3.1 stGFP156-5AB 部分
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 方法和结果
• 3.1.3 分析和讨论
• 3.2 stGFP172-5AB 部分
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 方法和结果
• 3.2.3 分析和讨论
• 3.3 EGFP172-5AB 部分
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.2 方法和结果
• 3.3.3 分析和讨论
• 3.4 小结
• 第4章 原核系统中NS3 丝氨酸蛋白酶的活性检测
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种和载体
• 4.1.2 工具酶，试剂（盒）
• 4.2 方法和结果
• 4.2.1 重组质粒pET-22b-NS3/4A 的构建
• 4.2.2 重组质粒pET-28a-EGFP 的构建
• 4.2.3 制备感受态细胞，实现共转化
• 4.2.4 SDS-PAGE 电泳
• 4.2.5 制片观察荧光现象结果
• 4.3 分析和讨论
• 4.4 小结
• 第5章 真核系统中报告质粒的构建
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌种和载体
• 5.1.2 细胞系和细胞培养基
• 5.2 方法和结果
• 5.2.1 pcDNA3.1（+）质粒载体的双酶切处理
• 5AB的构建'>5.2.2 重组质粒pcDNA3.1-E172_5AB的构建
• 5.2.3 重组质粒pcDNA3.1-E172N-2A-E172C 的构建
• 5.2.4 转染后观察绿色荧光现象
• 5.3 分析和讨论
• 5.4 小结
• 第6章 真核系统中NS3 丝氨酸蛋白酶的活性检测
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 菌种和载体
• 6.1.2 细胞系和细胞培养基
• 6.2 方法和结果
• 5AB-2A-NS3/4A 表达质粒的构建'>6.2.1 重组质粒pcDNA3.1-E172_5AB-2A-NS3/4A 表达质粒的构建
• 6.2.2 重组质粒pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A 表达质粒的构建
• 6.2.3 转染后观察绿色荧光现象
• 6.3 分析和讨论
• 6.4 小结
• 第7章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract