MSP58基因在人脑神经胶质瘤增殖和侵袭中的作用及其机制研究

论文摘要

神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,在所有颅内肿瘤中胶质瘤约占40%,预后较差,其中恶性胶质母细胞瘤的平均生存期仅为9-12月[1-2]。尽管近年来在手术﹑化疗与放疗方面取得很大进步,但对胶质瘤的治疗效果并没有得到显著提高。现在美国每年大约有20000人被诊断为胶质瘤,另有研究表明在中国的大陆、台湾及香港等地区,胶质瘤在青少年中的发病率呈增长的趋势[3-5]。恶性胶质瘤治疗困难的原因之一在于其所具有的恶性生物学特性,如胶质瘤具有典型的过度增殖和极强的侵袭性。因此寻找关键的治疗胶质瘤的分子靶点,纠正和改善其恶性生物学行为,越来越受到研究者们的高度重视。为了寻找治疗神经胶质瘤的分子靶点,1999年我校生物化学与分子生物学教研室利用基于PCR的削减杂交技术进行神经胶质瘤与正常脑组织的基因表达差异研究时,发现一个在胶质瘤中低表达的新基因NDRG2（N-myc down-stream regulated gene 2）[GenBank登录号AF159092][6]。NDRG2的mRNA全长为2024 bp,编码一个含有357个氨基酸残基、分子量约为41kDa的蛋白。该基因染色体定位在14 q11.2,含有16个外显子,15个内含子。由于该基因在结构上与已经发现的N-myc下游调节基因NDRG1（N-myc down-stream regulated gene 1）具有较高的同源性,将其命名为NDRG2。初步研究表明,过表达NDRG2可以抑制胶质瘤细胞的增殖。但目前国内外对NDRG2功能的研究尚处于起步阶段,对该基因抑制胶质瘤增殖的信号转导途径尚不清楚。阐明相关的分子机制有利于为NDRG2功能的研究提供理论依据,同时也为发展临床胶质瘤的治疗提供新的途径。绝大多数分子在细胞内执行功能都是通过蛋白与蛋白之间的相互作用来实现的。研究一个新基因的功能有多种策略,其中一个重要手段是寻找与之相互作用的蛋白分子,尤其是对于在结构分析中未见到任何功能提示的分子,这更是一个关键策略。为了深入地阐明NDRG2的功能及其在细胞内的作用机制,我们以NDRG2为诱饵利用酵母双杂交的方法筛选了人脑的cDNA文库。结果发现了一个可以与NDRG2相互作用的分子MSP58（58-kDa microspherule protein）,并通过在体内外实验验证了两个分子之间的相互作用[7],通过构建NDRG2和相互作用分子的截短体,确定了它们相互作用的部位。MSP58成为阐明NDRG2基因功能的新线索。MSP58是我们以NDRG2为诱饵利用酵母双杂交的方法筛选到的一个可以与NDRG2相互作用的分子。MSP58全长462个氨基酸。该分子结构中包括:核仁定位信号;一个coiled-coil domain和一个forkhead associated domain（FHA）[8]。目前国际上对MSP58的研究表明:MSP58的表达与细胞的增殖能力呈正相关[9],这个分子在细胞中表达具有明显的细胞周期相关的特点,它在细胞中过表达可以引起细胞的克隆形成能力增强及非锚着依赖生长的恶性表型,MSP58可以与多种在肿瘤的增殖及发生过程中有着重要作用的分子产生相互作用[10],是一个在肿瘤的增殖中有着重要作用的癌基因。那么MSP58基因在神经胶质瘤中是否有表达?其表达的程度如何?增殖和侵袭力强是神经胶质瘤明显的生物学特性,MSP58是否对胶质瘤的增殖和侵袭有作用?其作用的分子机制是什么?本课题就基于这些问题展开了探索工作。本研究收集了41例不同病理级别的神经胶质瘤的标本,应用RT-PCR和Western blot实验方法,探索MSP58基因在神经胶质瘤中mRNA和蛋白的表达情况,并进一步分析了MSP58分子的表达与神经胶质瘤病理级别之间可能存在的相互关系。结果发现,MSP58 mRNA和蛋白在不同病理级别的神经胶质瘤中均有表达,并且随着WHO的临床病理级别的增高,MSP58的表达亦有增高的趋势。本研究进一步采用了四种最高级别恶性度的神经胶质瘤的细胞系:U251,U87,BT325,SHG44,同样应用RT-PCR和Western blot的实验方法,检测了MSP58 mRNA和蛋白在这四种胶质瘤细胞系中的表达情况。结果发现,MSP58在胶质瘤细胞系均有高表达,并且表达量基本一致。根据这四种胶质瘤细胞系的生物学特性及转染效率等特点,我们选取了胶质瘤细胞系U251为研究对象,根据MSP58分子的cDNA序列,设计、合成了针对MSP58 mRNA的特异性RNAi片段,并克隆入pSilencer3.1-H1neo载体,构建了MSP58 shRNA真核干涉表达载体pSilencer-MSP58 ,经酶切鉴定证实克隆正确。通过脂质体介导将pSilencer-MSP58载体和空载体pSilencer3.1-H1neo和阴性对照载体pSilencer-NC分别转染入人脑胶质母细胞瘤细胞U251,经G418筛选,建立了稳定转染的细胞系U251-S（MSP58干涉组）、U251-H1neo（空载体组）和U251-NC（阴性对照载体组）。经RT-PCR和Western blot检测证实U251-S细胞MSP58mRNA和蛋白的表达明显受到抑制。从而首次成功地获得了能够稳定下调MSP58表达的胶质瘤细胞系U251-S。这为进一步研究MSP58在胶质瘤细胞中的功能和作用机制奠定了实验基础。本研究首先观察了MSP58基因对胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响。实验分为U251-S组（MSP58干涉组）、U251组（未转染组）、U251-H1neo组（空载体转染组）和U251-NC组（阴性对照载体转染组）。应用流式细胞术检测细胞周期,MTT实验绘制细胞生长曲线,平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验测定细胞克隆形成数量。结果发现U251-S组与其它各对照组相比,G1期细胞明显增加（p<0.01）,G2/M期细胞明显减少（p<0.01）,细胞周期发生了G1期阻滞现象;U251-S细胞增殖数和克隆形成数均明显低于其它各对照组（p<0.01）。表明MSP58基因对胶质瘤细胞周期有重要影响,MSP58基因表达下调对细胞增殖也有明显的抑制作用。为了探明MSP58基因与胶质瘤的侵袭和迁移能力的关系,采用经典的细胞划痕实验和Transwell侵袭小室法,就MSP58分子对细胞的迁移和侵袭能力的影响进行了研究。结果发现,U251-S组的胶质瘤细胞的迁移能力明显低于其它对照组（p<0.01）,并且在Transwell实验中,U251-S组的胶质瘤细胞能够穿过Matrigel的细胞数也明显低于其它对照组（p<0.01）。从而证明下调MSP58基因的表达能够抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。本研究采用裸鼠荷瘤实验进一步验证了以上结果在体内的重复性。32只裸鼠随机分为四组,将U251-S、U251、U251-H1neo和U251-NC组的细胞分别注入各组裸鼠皮下,观察其在裸鼠体内的成瘤性。共观察了24天。结果显示,U251-S组细胞在裸鼠体内的成瘤能力和生长速度明显低于其它对照组（p<0.01）,肿瘤体积和重量明显低于其它各对照组（p<0.01）。在体实验结果进一步印证了MSP58基因表达的下调抑制了神经胶质瘤的增殖和侵袭能力。在上述研究的基础上,本研究使用美国SuperArray公司推出的第二代功能分类基因芯片,对MSP58对照组和干涉组细胞的细胞周期和肿瘤相关基因进行了基因芯片对比分析研究,探讨MSP58作用的信号途径。美国SuperArray基因芯片对基因进行了有目的的筛选与分类,从而避免了高通量基因芯片因数据过多而难以分析的缺点。基因芯片的分析结果显示:MSP58的下调引起了某些抑癌基因的上调,如BRCA1和P53基因,同时也下调了某些增殖相关基因如Ki-67和E2F2的表达。对于细胞周期相关基因芯片而言,一些与细胞周期中G1-S期细胞周期转换抑制的相关基因,如ATM,ATR,CyclinG1,CyclinG2,Cullin4A以及Cullin5等均出现了上调。同时一些与细胞周期G2/M期有密切关系的基因如ANAPC2,ANAPC4以及ANAPC5出现了上调。本研究发现MSP58基因在神经胶质瘤细胞中的表达,且表达水平随神经胶质瘤病理级别的增高而升高;利用RNAi技术,首次建立了具有稳定下调MSP58基因mRNA和蛋白表达的胶质瘤细胞系;阐明了MSP58基因在神经胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用,并探索其作用的分子机制与信号转导途径。作为与NDRG2相互作用的分子,本研究结果为NDRG2功能的研究开辟了新的领域,也为发展临床神经胶质瘤的治疗提供了新的靶点。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 实验一 MSP58 基因在人脑胶质瘤中的表达及意义
• 1 材料
• 1.1 组织标本和细胞系
• 1.2 主要试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 器具准备
• 2.2 总RNA提取
• 2.3 RT反应
• 2.4 PCR反应
• 2.5 Western blot
• 2.6 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 MSP58 在四种人脑胶质瘤细胞系中的表达情况
• 3.2 MSP58 在不同级别人脑胶质瘤中的表达情况
• 4 讨论
• 实验二 稳定整合MSP58 基因RNA干涉载体的胶质瘤细胞系的建立
• 1 材料
• 1.1 细胞系、菌种、质粒
• 1.2 主要试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 人MSP58 基因RNAi特异性片段的设计及合成
• 2.2 人 MSP58 基因 shRNA 真核干涉表达载体 pSilencer-MSP58 的构建和鉴定
• 2.3 基因转染及稳定转染细胞系 U251-S、U251-H1neo 和 U251-NC 的建立
• 2.4 RT-PCR反应
• 2.5 Western blot
• 2.6 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 人MSP58 基因真核干涉表达载体的构建和鉴定
• 3.2 稳定转染细胞系的建立
• 3.3 shRNA抑制MSP58 mRNA在U251-S细胞中的表达
• 3.4 shRNA抑制MSP58 蛋白在U251-S细胞中的表达
• 4 讨论
• 4.1 RNA干涉现象
• 4.2 shRNA对MSP58 基因表达的抑制作用
• 实验三 MSP58 基因RNAi对人脑胶质瘤细胞体外增殖及侵袭的影响
• 1 材料
• 1.1 主要仪器和试剂
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 化学合成小片段siRNA瞬转胶质瘤细胞系
• 2.3 倒置相差显微镜观察
• 2.4 四唑兰显色法（MTT法）绘制细胞生长曲线
• 2.5 平板克隆形成实验
• 2.6 软琼脂集落形成实验
• 2.7 流式细胞术（FCM）检测细胞周期
• 2.8 流式细胞术检测细胞凋亡
• 2.9 单层细胞划痕实验检测细胞的迁移能力
• 2.10 Transwell侵袭小室实验检测细胞的侵袭能力
• 2.11 美国SuperArray公司基因功能分类芯片实验
• 2.12 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 化学合成小片段siRNA瞬转胶质瘤细胞转染效率的确认
• 3.2 化学合成小片段siRNA瞬转胶质瘤细胞干涉效果的确认
• 3.3 倒置相差显微镜观察稳转细胞系U251-S形态的变化
• 3.4 MTT法测定细胞生长增殖曲线
• 3.5 平板克隆形成实验
• 3.6 软琼脂集落形成实验
• 3.7 流式细胞术测定细胞周期
• 3.8 流式细胞术检测细胞凋亡结果
• 3.9 单层细胞划痕实验检测细胞的迁移能力
• 3.10 Transwell侵袭小室实验检测细胞的侵袭能力
• 3.11 基因表功能分类芯片检测 MSP58RNAi后对细胞周期和肿瘤相关达的影响
• 4 讨论
• 4.1 MSP58 RNAi对U251 细胞体外增殖、侵袭和迁移能力的影响
• 4.1.1 肿瘤发生发展的细胞周期机制
• 4.1.2 Cyclin的异常
• 4.1.3 CDK的增多
• 4.1.4 CKI表达不足和突变
• 4.2 基因芯片技术观察对肿瘤细胞周期和肿瘤相关基因的影响
• 实验四 MSP58 基因RNAi对胶质瘤裸鼠体内成瘤、增殖、侵袭的影响
• 1 材料
• 1.1 细胞系和裸鼠
• 1.2 主要试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 人脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型的建立及观测
• 2.2 HE染色
• 2.3 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 裸鼠皮下移植瘤生长的观察与测量
• 3.2 HE染色结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢