决定Ago2在P-Body定位的关键氨基酸

论文摘要

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链（double-stranded RNA,dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。Ago（Argonaute）蛋白家族是含有PIWI和PAZ基本结构域的一类成员数目较多的蛋白家族,近年来研究发现Ago蛋白家族的很多成员在RNA干扰现象中有重要的作用。在果蝇和人体细胞中,Ago2（Argonaute 2）为RNA干扰机器RSIC（RNA-induced silencing complex）的核心部分,在RNA干扰中发挥关键的作用。P-Body（Cytoplasmic Processing Body）最初在酵母中发现。在它细胞中与RNA降解有关。目前已经发现很多和RNA转录调控、RNA降解以及相关的蛋白在P-Body内聚集。现在,已有充分证据证明RNAi体系和P-body的形成有关联。例如RNA干扰机器RSIC上的核心蛋白Ago2也在P-body内聚集;Ago2与mRNA的结合会影响P-Body在细胞的存在状态等等。因为Ago2及P-Body和RNAi现象紧密联系,所以研究Ago2在P-Body内的定位对于了解P-Body和RNAi的关系有重要的意义。本论文通过构建一系列的Ago2突变子使用荧光免疫染色方法来寻找影响Ago2定位于P-Body的关键氨基酸。我们随机得到一个有六个氨基酸发生突变的Ago2突变子,为Ago2-G32W-F128L-R196Q-P458S-T741A-S752G,它完全不在P-Body内定位。这六个氨基酸单点突变子都不能使Ago2完全定位于P-Body之外。相对于其他的五个氨基酸我们发现Ago2上第752位的Ser对于Ago2在P-Body的定位尤为重要。当Ago2第752位Ser突变为Gly时,Ago2在P-body的定位率大大降低。但是单独的第752位Ser的突变还不足以使Ago2完全不定位于P-Body之外,实验发现它还需要第32位Gly、128位Phe、458位Pro突变的协助,Ago2四点突变子Ago2-G32W-F128L-P458S-S752G完全不在P-Body中定位。说明四个氨基酸突变的协同作用决定了Ago2不在P-Body内聚集。

论文目录

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• 1 前言
• 1.1 Argonaute蛋白家族
• 1.1.1 Argonaute蛋白家族简介
• 1.1.2 Ago2的发现
• 1.1.3.Ago蛋白的结构
• 1.2 Ago2与RNA干扰
• 1.2.1 Ago2与siRNA
• 1.2.2 Ago2与miRNA（microRNA）
• 1.3 P-Body
• 1.3.1 P-Body的发现
• 1.3.2 P-Body主要含有三种组分
• 1.3.3 P-Body与mRNA降解
• 2 材料和方法
• 2.1 常用药品和试剂
• 2.2 DNA相关实验方法
• 2.2.1 质粒载体
• 2.2.2 大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞的制备和DNA转化
• 2.2.3 质粒DNA的提取
• 2.2.4 质粒DNA的工具酶处理
• 2.2.5 纯化DNA片段
• 2.2.6 DNA连接反应
• 2.2.7 PCR相关实验
• 2.2.8 哺乳动物细胞表达质粒的构建
• 2.3 细胞培养及转染
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.2 瞬时转染
• 2.3.3 细胞免疫荧光染色
• 2.4 蛋白质的SDS-PAGE电泳与Western blot分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 结果与分析
• 3.1.1GFP-DCP1拼接质粒的构建
• 3.1.2 Ago2点突变体的构建
• 3.1.3 Ago2单点突变子不影响Ago2定位于P-Body
• 3.1.4 不含752Ser的多点突变不影响Ago2在P-Body中的定位
• 3.1.5 Aog2第725位Ser的突变对Ago2在P-Body的定位有明显影晌
• 3.1.6 32Gly、128Phe、458Pro、752Ser的协同作用决定了Ago2的定位
• 3.2 总结
• 附录:图表索引
• 参考文献
• 致谢