大鼠间充质干细胞于下肢缺血组织中转归的研究

论文摘要

目的:建立实验动物(Lewis大鼠)下肢缺血模型,提取、分离纯化骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),BrdU标记后大鼠患肢局部注射,明确移植干细胞在生物体内的真实转归,探讨干细胞治疗动脉缺血性疾病的确切机理。方法:采用手术缝扎、切除实验动物(大鼠)股动脉及其分支,结合内膜损伤、局部血栓形成等因素,对实验动物(大鼠)下肢缺血模型的制作,采用激光多普勒血流、血压分析、组织学检测、Ⅷ因子免疫组化及下肢血管造影等方法证实;用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,传代扩增,测定生长曲线,通过形态学观察,细胞化学及免疫细胞化学法分析大鼠骨髓MSCs的表型和功能特点,并BrdU标记。将BrdU标记的大鼠间充质干细胞进行患肢移植,对侧行盐水注射。结果:血管造影等检查显示术后实验动物(大鼠)下肢的细微侧支血管记数增加、血压显著下降、血流显著下降,下肢肌肉的组织学研究显示有萎缩、纤维化、坏死和炎性细胞浸润。贴壁培养法是一种简便易行的MSCs培养方法,操作简单、成功率高,可作为培养大鼠MSCs的常规方法。植入缺血区的MSCs部分形成血管样结构,移植组血管数量增多,下肢缺血状态改善。结论:间充质干细胞(MSCs)主要存在于骨髓中,是多潜能干细胞,在脐血、外周血、脂肪、皮肤等多种组织中也相继分离出。具有独特的免疫特性,在异种异体环境内长期存在,使其临床应用前景更为广泛。目前,MSCs的分离培养、诱导分化及鉴定体系已趋成熟,理论上可分化为所有中胚层来源的细胞,血管内皮细胞来源于中胚层,因此具有分化为血管内皮细胞的可能性。MSCs移植缺血下肢后,可明显改善下肢血供,促进侧枝循环建立。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一章 前言
• 第二章 实验过程
• 1.主要实验仪器
• 2.主要实验试剂
• 3.实验动物
• 实验一 lewis大鼠下肢缺血模型的制作与评价
• 1.实验方法
• 1.1 目的
• 1.2 实验步骤
• 1.2.1 制作动物模型
• 1.2.2 术后观察
• 1.2.3 评估方法
• 1.2.4 统计分析
• 2.结果
• 实验二 大鼠间充质干细胞的分离培养及BrdU标记
• 1.实验方法
• 1.1 大鼠骨髓MSCs的体外分离培养
• 1.2 MSCs生长曲线测定
• 1.3 传代后大鼠MSCs的标记
• 1.3.1 BrdU标记免疫组化染色操作步骤
• 1.3.2 对照试验
• 1.4 统计学处理
• 2.结果
• 实验三 骨髓间充质细胞于大鼠下肢缺血组织中的分布与转归
• 1.实验方法
• 1.1 骨髓间充质干细胞移植
• 1.2 数字减影血管造影
• 1.3 组织染色
• 1.4 移植细胞的鉴定
• 2.结果
• 第三章 结果
• 第四章 讨论
• 1.下肢缺血性疾病治疗现状
• 2.大鼠下肢慢性缺血模型的制作
• 3.间充质干细胞多向分化的研究
• 4.间充质干细胞的分离培养及BrdU标记
• 4.1 骨髓间充质干细胞的分离纯化
• 4.2 骨髓间充质干细胞的生物特性
• 4.2.1 光镜下的形态特征
• 4.2.2 电镜下的形态特征
• 4.2.3 骨髓间充质干细胞增殖特性
• 4.2.4 骨髓间充质干细胞免疫特性
• 4.2.5 骨髓MSCs的鉴定
• 4.2.6 间充质干细胞BrdU标记
• 5.干细胞移植治疗下肢缺血性疾病基础研究
• 5.1 MSCs诱导分化为内皮细胞的理论基础
• 5.1.1 与早期内皮细胞发育的联系
• 5.1.2 MSCs与内皮前期细胞（EPC）
• 5.2 细胞体外分化为内皮细胞的实验细胞学基础
• 5.3 MSCs向血管内皮样细胞分化机制探讨
• 6.骨髓间充质干细胞的临床应用
• 7.现阶段存在问题
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 在校期间科研成果及发表论文