紫草素对人气道平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制的探讨

论文摘要

一、研究背景支气管哮喘是气道的慢性炎症性疾病,其反复发作可引起气道重构,导致不可逆性气流阻塞及持续性非特异性气道高反应性。其中气道平滑肌细胞（airwaysmooth muscle cells,ASMCs）的增殖是气道重构的重要原因之一。紫草素（shikonin）是从中国传统中药材—紫草的根中提取的一种萘醌类化合物,国内外众多研究表明紫草素及其衍生物具有明确的抗炎、抗氧化,抗细菌、真菌,抑制肿瘤细胞及血管平滑肌细胞增殖、促进凋亡,抗血管新生,抗HIV等多种生物学效应。其是否对人气道平滑肌细胞（human airway smooth musclecells,HASMCs）有抑制增殖的作用,国内外尚未见相关研究。二、研究目的本实验以体外培养的HASMCs为研究对象,观察紫草素对HASMCs增殖的影响,并对其作用机制作初步的探讨,为其治疗支气管哮喘气道重构提供实验依据。三、材料和方法1、经患者同意,取南方医院胸外科同期做肺叶切除术患者的正常肺叶、段支气管标本。2、组织块贴壁法培养人支气管平滑肌细胞,倒置显微镜观察和抗平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体（α-actin）免疫细胞化学法进行HASMCs鉴定。3、经0μmol/L（对照组）及0.5、1、2、5、10、20、40μmol/L浓度的紫草素分别作用12、24、48h后,应用MTS法测定紫草素对HASMCs的细胞增殖的影响。4、经0μmol/L（对照组）及5、10、20、40μmol/L浓度的的紫草素分别作用24h后,应用流式细胞术分析紫草素对细胞周期的影响。5、经0μmol/L（对照组）及20μmol/L浓度的紫草素分别作用24h后,应用SP免疫细胞化学法检测紫草素对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuelearantigen,PCNA）及P21蛋白表达的影响。6、经0μmol/L（对照组）及20μmol/L浓度的紫草素分别作用24h后,应用逆转录多聚酶链反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测紫草素对P21基因表达的影响。7、统计学处理所有数据均以（?）±s表示,MTS结果采用重复测量数据的方差分析,两样本均数比较采用两独立样本t检验,多组均数比较采用单向方差分析（One-WayANOVA）,各组间比较采用LSD法。采用SPSS13.0软件进行处理,以P＜0.05表示差异有统计学意义。四、结果1、HASMCs的形态及免疫细胞化学鉴定倒置显微镜下ASMCs呈长梭形,生长至融合后,细胞呈现出特征的“峰谷”状。免疫细胞化学法对α-actin鉴定,光镜下可见细胞浆中较多棕黄色颗粒。2、紫草素对HASMCs增值的影响在紫草素作用12h时,0μmol/L（对照组）及0.5、1、2、5、10、20、40μmol/L浓度的紫草素组细胞吸光度（OD值）分别为:1.356±0.203,1.370±0.314,1.439±0.942,1.304±0.120,1.235±0.256,1.347±0.285,0.978±0.097,0.707±0.066。在紫草素作用24h时,0μmol/L（对照组）及0.5、1、2、5、10、20、40μmol/L浓度的紫草素组细胞OD值分别为:1.339±0.209,1.285±0.260,1.264±0.198,1.270±0.258,1.285±0.211,1.291±0.181,0.918±0.212,0.718±0.214。在紫草素作用48h时,0μmol/L（对照组）及0.5、1、2、5、10、20、40μmol/L浓度的紫草素组细胞OD值分别为:1.084±0.166,1.081±0.246,1.062±0.268,1.061±0.283,1.197±0.189,1.227±0.163,0.833±0.368,0.749±0.424。统计学分析显示:0.5、1、2、5、10μmol/L紫草素组与对照组间OD值差异不显著（F=932.578,P值分别为0.926、0.978、0.753、0.893、0.849）;20μmol/L和40μmol/L紫草素组与对照组OD值比较,差异有统计学意义（F=932.578,P值分别为0.033、0.003）,但两者之间差异不显著（F=932.578,P:0.233）;不同浓度紫草素作用12h与24hOD值相比,无显著性差异（F=6.491,P=0.254）。但两者与48 hOD值相比,差异均有统计学意义（F=6.491,P值分别为0.018、0.007）;时间与浓度无交互作用（P=0.905）。3、紫草素对HASMCs细胞周期的影响经0μmol/L（对照组）及5、10、20、40μmol/L浓度的紫草素分别作用24h后,细胞G0/G1期比例分别为（75.0±9.0）%,（83.2±6.4）%,（85.0±6.5）%,（90.8±2.7）%,（91.7±2.4）%。其中,5μmol/L和10μmol/L浓度的紫草素组与对照组间差异无统计学意义（F=3.884,P值分别为0.120、0.065）。20μmol/L和40μmol/L浓度的紫草素组与对照组间差异有统计学意义（F=3.884,P值分别为0.008、0.006）,但两者之间无显著性差异（F=3.884,P=0.857）。细胞G2/M期比例分别为（8.8±5.9）%,（7.9±9.0）%,（7.5±6.9）%,（5.3±3.4）%,（3.1±0.6）%,各组间无显著性差异（F=0.459,P=0.765）。细胞S期比例分别为（13.2±7.6）%,（8.9±4.4）%,（7.5±4.5）%,（3.9±0.7）%,（4.8±1.0）%,各组间无显著性差异（F=2.088,P=0.157）。4、紫草素对PCNA及P21蛋白表达的影响。经0μmol/L（对照组）及20μmol/L浓度的紫草素分别作用24h后,细胞PCNA阳性表达率分别为:（74.1±10.7）%,（41.8±3.1）%。二者差异有统计学意义（t=5.015,P=0.007）。经0μmol/L（对照组）及20μmol/L浓度的紫草素分别作用24h后,细胞P21阳性表达率分别为:（9.3±2.5）%,（23.0±7.0）%。二者差异有统计学意义（t=3.182,P=0.033）。5、紫草素对P21基因表达的影响。经0μmol/L（对照组）及20μmol/L浓度的紫草素分别作用24h后,P21基因表达相对量分别为:0.311±0.007,0.571±0.149。二者差异有统计学意义（t=3.013,P=0.039）。五、结论1、20μmol/L和40μmol/L浓度的紫草素可抑制人气道平滑肌细胞的增殖,其抑制作用以48h最强。2、20μmol/L和40μmol/L浓度的紫草素可提高人气道平滑肌细胞G0/G1期细胞的比例,阻滞细胞周期进程。3、20μmol/L浓度的紫草素可抑制人气道平滑肌细胞PCNA蛋白的表达,提高P21蛋白的表达。4、20μmol/L浓度的紫草素可提高人气道平滑肌细胞P21基因的表达。5、紫草素能有效抑制人气道平滑肌细胞的增殖,其机制可能是通过上调P21基因和蛋白的表达而起作用的。

论文目录

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