内皮祖细胞修复慢性脊髓损伤的实验研究

论文摘要

目的1.设计三种脊髓压迫装置,通过比较确定最佳装置,为进一步研究慢性脊髓压迫损伤的病理以及恢复奠定基础。2.从大鼠骨髓中分离出单个核细胞,使用诱导的培养基使其向内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）分化后,将其注入减压模型以研究内皮祖细胞在慢性脊髓压迫模型减压后对其恢复效果的影响。方法1.通过AutoCAD201064x与Solidworks201064x软件设计并制作3种脊髓压迫固定装置。取健康雄性Wistar大鼠29只编号后通过随机数字生成器随机分成实验对照组（n=5）、简单直板压迫组（simple plate, SP组）（n=8）、弹性桥压迫组（elastic bridge, EB组）（n=8）；抽屉尾翼钩型压迫组（drawer-hook,D-H组）（n=8）。实验对照组只进行椎板切除术,实验组分别植入3种压迫装置,植入一周后进行拉力拔出实验,模型制成压迫6周后进行TUNEL染色观察细胞凋亡情况。2.取4-6周龄Wistar大鼠（125-150g）双股骨及胫骨骨髓,通过密度梯度离心法分离单个核细胞,使用内皮系专用培养基EGM-2MV诱导培养,使其分化为内皮祖细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长情况,通过流式细胞术其细胞诱导培养第7天测定细胞表面抗原CD133、CD34、KDR表达情况,并通过荧光供聚焦显微镜观察细胞摄取Dil-acLDL与结合FITC-UEA-1能力,从功能学方面进一步鉴定诱导培养后的细胞为血管内皮祖细胞。3.15只已制作成功的大鼠慢性脊髓压迫模型压迫6周后随机分为模型对照组（n=5）、单纯减压组（n=5）和减压联合EPCs注射组（n=5）,进行BBB评分后进行减压并拆除装置。减压联合EPCs注射组减压后立即给予细胞量为105的EPCs（10u）进行局部注射,单纯减压组给予PBS10u局部注射。观察4周后在进行BBB评分,并且取脊髓标本进行ChAT荧光染色,进行统计学分析。结果1.从X线观察中3组装置植入1周后SP与D-H无明显脱位,EB组装置尾端向后脱位。拉力测定显示在装置拔出植入后样本5mm范围内D-H拉力最大值为245.4±12.83,SP组和EB组分别为7.67±0.70和25.77±21.55对进行方差分析,组间有显著差异（P<0.05）。D-H在拔出过程中出现拉力突越现象。压迫6周后进行TUNEL染色显示3组压迫模型产生的阳性细胞数目均有显著差异（P<0.05）。2.通过细胞形态变化的观察、流式细胞术在培养第7天对表面抗原CD133,CD34和KDR的检测,表达分别为57.5%、11.4%和19.2%,和鉴定细胞功能的双吞实验证实本实验分离和经过EGM-2MV诱导培养所获细胞为大鼠骨髓内皮祖细胞。3.减压4周后单纯减压组和减压联合EPCs注射组与减压前BBB评分都较减压时都有显著差异（P<0.05）,两组模型减压4周后与减压前BBB评分差异各有统计学差异（P<0.05）。模型对照组的ChAT阳性细胞数目为4.4±1.67,单纯给予减压后4周ChAT阳性细胞数目为7.0±1.22,给予减压联合EPCs注射组17.4±3.58。组间皆有显著差异（P<0.05）。结论1.应用AutoCAD2010及Solidworks2010软件设计的三种大鼠慢性脊髓压迫模型中D-H型装置固定最为可靠,可控性强。更符合后路慢性渐进性压迫模型装置的要求。2.在慢性脊髓压迫模型减压后应用EPCs注射比单纯减压在4周时运动神经元功能的恢复程度高。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 縮略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、三种大鼠慢性脊髓压迫装置的设计与分析
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要实验器械
• 1.1.3 实验试剂
• 1.1.4 实验分组
• 1.1.5 装置制作方法
• 1.1.6 手术安放装置过程
• 1.1.7 手术后后续操作
• 1.1.8 拔出力测量
• 1.1.9 TUNEL染色
• 1.2 结果
• 1.2.1 三种压迫装置
• 1.2.2 X线检查装置安装情况
• 1.2.3 拔出力测试
• 1.2.4 TUNEL染色检测压迫效果
• 1.3 讨论
• 1.3.1 脊髓损伤模型的历史回顾
• 1.3.2 三种压迫装置的对比
• 1.3.3 装置的安装
• 1.3.4 TUNEL染色差异
• 1.4 小结
• 二、内皮祖细胞的提取、培养、诱导分化及鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验设备
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 提取细胞
• 2.1.5 细胞活力的测定
• 2.1.6 骨髓源大鼠EPCs鉴定
• 2.2 结果
• 2.2.1 大鼠骨髓单个核细胞的分离
• 2.2.2 细胞形态学观察
• 2.2.3 EPCs细胞表型鉴定
• 2.2.4 细胞功能学鉴定
• 2.3 讨论
• 2.3.1 内皮祖细胞的发现
• 2.3.2 提取方法
• 2.3.3 EPCs鉴定
• 2.4 小结
• 三、内皮祖细胞植入损伤模型的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验分组
• 3.1.3 BBB评分
• 3.1.4 细胞注射
• 3.1.5 ChAT染色
• 3.2 结果
• 3.2.1 BBB评分
• 3.2.2 ChAT免疫荧光
• 3.3 讨论
• 3.3.1 乙酰胆碱转移酶与前角运动神经元的关系
• 3.3.2 EPCs移植修复血管的机制
• 3.3.3 EPCs与慢性脊髓损伤
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 内皮祖细胞的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢