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伪狂犬病gE-/gI-基因缺失突变株及禽流感假病毒的构建以及免疫效果的研究

2020-11-28阅读(98)

伪狂犬病gE-/gI-基因缺失突变株及禽流感假病毒的构建以及免疫效果的研究

论文摘要

1伪狂犬病毒鄂A株gE-/gI-基因缺失突变株的研究伪狂犬病是威胁世界养猪业的主要疾病之一。虽然美国和欧洲一些国家已经根除了该病,但是在中国和世界上许多其他国家,伪狂犬病每年仍然给这些国家带来巨大的经济损失。根除伪狂犬病的过程中,gE基因缺失疫苗配合相应的鉴别诊断方法至关重要的。本研究报道构建一种gE基因缺失疫苗株,并且通过动物试验来检验该疫苗株的免疫保护效果,拟研究适合种猪使用且安全高效的灭活疫苗。主要研究内容及结果如下:1.1伪狂犬病病毒鄂A株gE-/gI-基因缺失突变株的构建伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）属疱疹病病毒科,α疱疹病毒亚科猪疱疹病毒Ⅰ型,具有强烈的神经嗜性和潜伏感染性。糖蛋白基因gE、gI是PRV的主要毒力基因,它们与PRV在神经元中的传递有关。本研究首先以限制性内切酶STUⅠ、BSTEⅡ双酶切质粒pIECMV,得到gE/gI缺失转移质粒pIESE。序列分析表明,该质粒缺失了从gI基因StuI位点到gE基因BstEII位点共计1247 bp的片断。用gE/gI缺失转移质粒pIESE与PRV Ea基因组共转染猪肾传代细胞IBRS-2,经过空斑筛选获得PRV Ea gE-/gI-突变株。经Southern杂交,蛋白质斑点杂交试验和间接免疫荧光分析证明重组病毒的gE和gI基因已经通过同源重组方式被读码框不完整的gE和gI基因替换掉。1.2 PRV gE-/gI-基因缺失突变株免疫效果的研究1.2.1 PRV gE-/gI-基因缺失突变株对Balb/c小鼠免疫效果的研究28只4周龄的雌性Balb/c小鼠,随机分成4组,每组7只由脚趾分别免疫剂量为105TCID50的重组PRV gI-/gE-灭活疫苗,PRV gG-/LacZ+灭活疫苗,Bartha株来源的商品化的gE-灭活疫苗和100μL的DMEM,并于第28 d进行第二次免疫。所有组的小鼠通过肌肉注射方式注入剂量为2×106TCID50PRV Ea株强毒。小鼠在免疫后的0、21、28、35、42、49和56采取血清作为免疫分析使用。PRV ELISA和中和抗体检测表明,所有免疫组在免疫后的第14 d都可以检测到PRV抗体,并且于二免后显著增长,在第42 d达到最高。gE缺失疫苗免疫组在免疫的各阶段没有检测到PRV gE-ELISA抗体。在攻毒实验中,PRV gI-/gE-和PRV gG-/LacZ+免疫组没有出现临床发病症状,全部存活。而免疫商品化gE缺失疫苗组在攻毒的后的第3d出现明显的临床症状并在第5d全部死亡。DMEM对照组在攻毒后的第1d就出现强烈的神经症状并于攻毒后的第2d全部死亡。结果表明,106TCID50 PRV Ea gE-/gI-能保护小鼠抵抗2×106TCID50PRV Ea株强毒的攻击。1.2.2 PRV gE-/gI-基因缺失突变株对新生仔猪免疫效果的研究20头14日龄的PRV抗体阴性的仔猪被随机分成4组,分别通过肌肉注射方式免疫,免疫剂量为105TCID50的PRV gI-/gE-灭活疫苗,RV gG-/LacZ+灭活疫苗,Bartha株来源的商品化的灭活疫苗和2 mL的DMEM。28d后以同样的途径和剂量进行二次免疫。分别与免疫后的0、21、28、35和42 d收集血清进行抗体分析。所有组的仔猪通过肌肉注射5×106TCID50的PRV Ea株强毒。PRV ELISA和中和抗体检测表明,所有免疫组在免疫后的第14 d都可以检测到PRV抗体。gE缺失疫苗免疫组在免疫的各阶段没有被PRV gE-ELISA检测到。在攻毒实验中,PRV gI-/gE-和PRV gG-/LacZ+免疫组没有出现临床发病症状,全部存活。在免疫商品化gE缺失疫苗组,有2只仔猪在攻毒的后的第5d出现明显的临床症状明显并在第10d死亡。DMEM对照组在攻毒后的第2d就出现强烈的神经症状并于攻毒后的第7d全部死亡。结果表明,105TCID50PRVEa gE-/gI-能提供完全保护小鼠抵抗5×106TCID50PRV Ea株强毒的攻击。2禽流感假病毒入侵模型的建立禽流感病毒的血凝素蛋白是病毒的表面抗原,具有免疫原性,可诱导抗体及细胞免疫,是决定宿主范围的因素之一。本研究将禽流感病毒H5N1亚型的HA蛋白整合到HIV-1构件的核衣壳内,包装成假病毒颗粒（HIV/H5-HA）,建立了模拟禽流感病毒入侵宿主的假病毒模型并将包装的假病毒免疫Balb/c雌性小鼠,从与受体结合,感染宿主细胞以及刺激机体产生保护性抗体3个方面对展示在HIV核衣壳表面的HA蛋白的功能进行验证。2.1 HIV/H5-HA的包装和检测根据A/chicken/Hubei/327/2004株AIV HA基因的核苷酸序列采用RT-PCR克隆了完整的HA基因序列至pcDNA3.1中,得到转移载体pBHHA。通过与含有HIV-1gag/pol构件的载体pCMV△8.2以及含有β-半乳糖苷酶报告基因的pHR’-CMVLacZ共转染293T细胞包装成假病毒HIV/H5-HA。Western blot检测的HA假病毒颗粒表达结果显示出3条特异性目的带,其大小与HA蛋白未经切割的前体蛋白HA0以及切割后形成的亚单位HA1和HA2大小相符,说明HA在假病毒颗粒表面得到了表达,并且表达的HA蛋白得到了正确的切割。通过流式细胞仪检测、电镜观察及细胞融合分析,进一步确定了HA蛋白成功的整合到HIV核衣壳内。通过LacZ染色,感染293T细胞,证明假病毒对细胞具有感染性。此外,为检验HIV/H5-HA是否如同天然禽流感病毒那样有着广泛的细胞嗜性,用HIV/H5-HA感染了MDCK等6种细胞,实验结果表明,HIV/H5-HA可以感染多种哺乳动物细胞。2.2 HIV/H5-HA模拟流感病毒入侵宿主细胞机制通过鸡红细胞凝集试验证明表达HA蛋白的HIV粒子可以与细胞表面的受体结合并使鸡红细胞发生凝集反应,其凝血效价达到25。本研究通过不同浓度的NH4Cl溶液与感染假病毒的的Vero细胞作用来模拟HIV/H5-HA在不同pH值下入侵细胞机制。结果表明,高pH值对HA假病毒进入宿主细胞具有明显的抑制作用,浓度为40 mmol/L的NH4Cl可以完全抑制HIV/H5-HA对细胞的感染性:而且HIV/H5-HA对细胞的感染与NH4Cl浓度成线性负相关关系（y=-0.028x+1.473,R2=0.960）,以上结果充分证明HIV/H5-HA是以一种pH依赖的方式感染宿主细胞的。同时也证明,禽流感假病毒模型可以作为禽流感病毒与宿主之间入侵和免疫应答等研究的技术平台。2.3 HIV/H5-HA对Balb/c免疫保护效果的研究5组雌性Balb/c小鼠,分别免疫不同剂量的HA假病毒,同时免疫灭活禽流感病毒和PBS注射组作为阳性对照和阴性对照。利用血凝抑制试验评价体液免疫效果。免疫一周后,HI抗体在假病毒免疫组被检测到,但在灭活疫苗对照组和阴性对照组没有检测出HI抗体。在免疫后的第二周,各免疫组的HI效价都迅速增长并在攻毒后的第一周达到最高值。在攻毒后的临床症状方面,阴性对照组的老鼠出现明显的临床症状（精神沉郁,反应迟钝,麻痹等）,并且体重较攻毒前减少了26.22%,最后在攻毒的6d内全部死亡。各免疫组在攻毒的第一周出现轻微的消瘦症状,并且在攻毒的第一周内平均体重减少12.78%-21.07%,但是平均体重在攻毒的第二周恢复到攻毒前的水平。以上实验数据显示,HA假病毒对老鼠具有良好的免疫保护效果。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表（Abbreviation）
  • -/gI-基因缺失突变株的构建以及免疫效果的研究'>第一章 伪狂犬病病毒鄂A株gE-/gI-基因缺失突变株的构建以及免疫效果的研究
  • 1 文献综述
  • 1.1 伪狂犬病病毒的分子生物学
  • 1.1.1 伪狂犬病病毒的结构
  • 1.1.2 伪狂犬病病毒的基因组
  • 1.1.3 伪狂犬病病毒的基因和蛋白质
  • 1.1.3.1 gE和gI糖蛋白
  • 1.1.3.2 其他主要糖蛋白
  • 1.2 致病机理
  • 1.2.1 神经嗜性
  • 1.2.2 潜伏感染
  • 1.3 伪狂犬病疫苗研究进展
  • 1.3.1 伪狂犬病病毒作为活病毒载体的应用
  • 1.3.2 伪狂犬病病毒疫苗研究进展
  • 1.3.2.1 自然弱毒疫苗
  • 1.3.2.2 亚单位疫苗
  • 1.3.2.3 核酸疫苗
  • 1.3.2.4 重组疫苗
  • 1.3.2.4.1 以腺病毒为载体的重组PRV疫苗
  • 1.3.2.4.2 以痘苗病毒为载体的重组PRV疫苗
  • 1.3.2.4.3 以伪狂犬病毒为载体的重组PRV疫苗
  • 1.3.2.5 基因缺失疫苗
  • 1.3.2.6 gE基因缺失疫苗在PRV根除计划中的作用
  • 2 研究目的与意义
  • 3 材料与方法
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 细胞、病毒、细菌、质粒和试剂
  • 3.1.2 培养基
  • 3.1.3 缓冲液
  • 3.1.3.1 制备质粒用缓冲液
  • 3.1.3.2 Southern杂交试剂
  • 3.1.3.3 Western blot相关溶液
  • 3.1.3.4 其它溶液
  • 3.1.3.5 试验动物
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 质粒DNA的制备、纯化
  • 3.2.1.1 质粒的小量制备（碱裂解法）
  • 3.2.1.2 质粒的大量制备（碱裂解法）
  • 3.2.2 感受态细胞的制备（氯化钙法）
  • 3.2.3 连接产物及质粒的转化
  • 3.2.4 重组质粒的鉴定
  • 3.2.5 Southern印迹
  • 3.2.6 蛋白质斑点印迹
  • 3.2.7 间接免疫荧光
  • 3.2.8 病毒基因组DNA的制备
  • 3.2.9 体外转染哺乳动物细胞脂质体转化法（LiPofection Reagent）
  • 3.2.10 空斑纯化
  • 3.2.11 病毒模板的制备（酚仿抽提法）
  • 3.2.12 灭活疫苗的制备
  • 3.2.12.1 病毒的接种与灭活
  • 3.2.12.2 乳化
  • 3.2.13 猪伪狂犬病毒普通ELISA抗体检测方法
  • 3.2.14 gE鉴别ELISA检测方法
  • 50)测定'>3.2.15 病毒组织培养半数感染(TCID50)测定
  • 3.2.16 中和试验（固定病毒—稀释血清法）
  • 3.2.17 数据处理
  • 4 结果与分析
  • 4.1 PRV Ea gE-/gI-缺失突变株的构建
  • 4.1.1 转移载体pIESE的构建
  • 4.1.2 PCR筛选的引物与条件
  • 4.2 缺失突变株的构建和筛选
  • -/gE-的鉴定'>4.3 PRV Ea gI-/gE-的鉴定
  • 4.3.1 Southern杂交鉴定
  • 4.3.2 间接免疫荧光检测（indirect immunofluorescence assay,IFA）
  • 4.3.3 蛋白质斑点印迹
  • 4.4 PRV Ea gI-/gE-免疫效果的研究
  • 4.4.1 PRV Ea gI-/gE-灭活疫苗的制备及检测
  • -/gE-灭活疫苗安全性检测'>4.4.2 PRV Ea gI-/gE-灭活疫苗安全性检测
  • -/gE-灭活疫苗对靶动物和非靶动物保护力的检测'>4.4.3 PRV Ea gI-/gE-灭活疫苗对靶动物和非靶动物保护力的检测
  • -/gE-灭活疫苗对Balb/c小鼠的免疫和保护'>4.4.3.1 PRV Ea gI-/gE-灭活疫苗对Balb/c小鼠的免疫和保护
  • 4.4.3.1.1 伪狂犬病病毒的中和抗体水平检测
  • 4.4.3.1.2 PRV-ELISA和PRV gE-ELISA抗体水平检测
  • 4.4.3.1.3 攻毒试验
  • 4.4.3.2 PRV Ea gI-/gE-灭活疫苗对断奶仔猪的免疫和保护
  • 4.4.3.2.1 伪狂犬病病毒的中和抗体水平检测
  • 4.4.3.2.2 PRV-ELISA和PRV gE-ELISA抗体水平检测
  • 4.4.3.2.3 攻毒试验
  • 5 讨论
  • 5.1 缺失突变株的构建
  • 5.2 PRV Ea gI-/gE-的免疫效果
  • 6 结论
  • 第二章 H5N1亚型血凝素蛋白假病毒的建立和免疫效果的研究
  • 1 文献综述
  • 1.1 禽流感病毒特性及研究进展
  • 1.1.1 禽流感病毒病原学综述
  • 1.1.1.1 禽流感的分类
  • 1.1.1.2 禽流感病的生物学性质
  • 1.1.1.3 禽流感病毒的国际检测标准
  • 1.1.2 禽流感病毒分子生物学特征及其变异
  • 1.1.3 传播途径和流行病学调查
  • 1.1.3.1 消化道传播
  • 1.1.3.2 呼吸道传播
  • 1.1.3.3 垂直传播
  • 1.1.3.4 迁徙传播
  • 1.1.4 血凝素（Hemagglutinin,HA）基因的研究
  • 1.1.4.1 HA蛋白结构
  • 1.1.4.1.1 一级结构
  • 1.1.4.1.2 HA蛋白的三维结构及受体结合部位
  • 1.1.4.1.3 HA蛋白的生物学功能
  • 1.1.4.2 HA蛋白在入侵宿主细胞过程中的作用
  • 1.1.4.3 禽流感病毒的切割位点
  • 1.1.6 流感疫苗的研究进展
  • 1.1.6.1 灭活全病毒疫苗
  • 1.1.6.2 减毒活疫苗
  • 1.1.6.3 亚单位疫苗
  • 1.1.6.4 以哺乳动物细胞为基质制备流感疫苗
  • 1.1.6.5 基于反向遗传技术改造的流感疫苗
  • 1.1.6.6 DNA疫苗
  • 1.2 逆转录病毒及其载体的分子遗传学特性
  • 1.2.1 病毒载体的发展简史
  • 1.2.2 逆转录病毒载体的特征
  • 1.2.3 逆转录病毒的分子结构及其遗传特征
  • 1.2.4 慢病毒裁体
  • 1.2.5 假病毒体系
  • 2 研究目的和意义
  • 3 材料与方法
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 质粒及细胞
  • 3.1.2 主要药品及试剂
  • 3.1.3 主要培养基
  • 3.1.4 抗生素的配制
  • 3.1.5 主要缓冲液的配制
  • 3.1.5.1 假病毒转染试剂
  • 3.1.5.2 质粒提取与鉴定试剂的配制缓冲液
  • 3.1.5.3 SDS-PAGE缓冲液
  • 3.1.5.4 Western blot缓冲液的配制
  • 3.1.5.5 其它试剂的配制
  • 3.1.6 实验动物
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 病毒RNA的提取及RT-PCR反应
  • 3.2.2 HA基因的克隆
  • 3.2.3 感受态细胞的制备（氯化钙法）
  • 3.2.4 连接产物及质粒的转化
  • 3.2.5 质粒的提取
  • 3.2.5.1 质粒的小量制备（碱裂解法）
  • 3.2.5.2 质粒的大量制备（碱裂解法）
  • 3.2.6 序列测定
  • 3.2.7 转移载体的构建
  • 3.2.8 假病毒的包装
  • 3.2.9 HA假病毒颗粒表达的检测
  • 3.2.9.1 Western-blot检测HA假病毒的表达
  • 3.2.9.2 FACS检测HA假病毒的表达
  • 3.2.9.3 细胞融合
  • 3.2.10 HA假病毒颗粒感染性的检测
  • 3.2.10.1 LacZ染色
  • 3.2.10.2 HA假病毒颗粒对不同细胞的感染
  • 3.2.11 HA假病毒颗粒pH值依赖性测定
  • 3.2.12 血凝价的检测（HA）
  • 3.2.13 HA假病毒颗粒的形态学观察
  • 3.2.14 HA假病毒免疫功能的研究
  • 3.2.14.1 1%鸡红细胞悬液和4单位抗原的制备
  • 3.2.14.2 血凝（HA）和血凝抑制（HI）
  • 3.2.14.3 免疫功能研究
  • 3.2.14.4 动物免疫与检测
  • 3.2.14.5 数据的统计分析
  • 4 结果与分析
  • 4.1 HA基因的RT-PCR扩增结果
  • 4.2 序列测定与分析
  • 4.3 转移载体的构建
  • 4.4 HA蛋白表达的检测
  • 4.4.1 Western-blot
  • 4.4.2 FACS法检测HA蛋白的表达
  • 4.5 细胞融合分析
  • 4.6 HA假病毒颗粒感染性的检测
  • 4.7 HA假病毒颗粒pH值依赖性测定
  • 4.8 血凝效价的检测
  • 4.9 HA假病毒颗粒的形态学观察
  • 4.10 HA假病毒免疫效果的研究
  • 5 讨论
  • 5.1 HA假病毒的包装与鉴定
  • 5.2 HA假病毒的模拟流感病毒入侵宿主细胞
  • 5.3 HA假病毒对Balb/c免疫功能的研究
  • 6 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

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    • [15].GE在城市土地勘测中的应用[J]. 河北农业科学 2009(09)
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