IL-2、IL-12、IL-15、IFNα对NK-92细胞颗粒酶基因表达水平的调控

论文摘要

目的人类天然杀伤细胞（NK细胞）是一种具有细胞毒作用的淋巴细胞,在天然免疫中起着重要作用,能迅速诱导病毒感染细胞或者肿瘤细胞的凋亡。NK细胞执行杀伤功能的途径有多种,包括Fas-L、TRAIL、穿孔素-颗粒酶途径;其中最主要的一条途径是穿孔素-颗粒酶途径。当NK细胞和靶细胞接触后,NK细胞能够分泌细胞毒颗粒进入靶细胞内。NK细胞能够分泌多种颗粒酶,包括颗粒酶A、B、H、K和M。颗粒酶基因在染色体的排列位置接近,而且具有共同的保守序列。颗粒酶B和颗粒酶H基因有90%是一致的;颗粒酶A和颗粒酶K也有很强的同源性。在五种颗粒酶中,颗粒酶B是目前研究最多的一种,而且在杀伤靶细胞中起着至关重要的作用。颗粒酶B杀伤靶细胞是通过半胱天冬酶依赖的凋亡途径;而颗粒酶A是通过诱导DNA单链断裂来诱导靶细胞凋亡的。因为作用的底物还不清楚,颗粒酶H和颗粒酶K被称为孤儿酶,并且它们诱导靶细胞凋亡不依赖半胱天冬酶凋亡途径。颗粒酶M是通过半胱天冬酶依赖的凋亡途径诱导靶细胞凋亡的。IL-2、IL-12、IL-15和IFNα是最重要的调节免疫功能的细胞因子,能够提高淋巴细胞的细胞毒作用。已经有文章报道IL-2、IL-12、IL-15和IFNα可以提高NK细胞杀伤效应分子的表达,促进靶细胞的凋亡。尽管如此,IL-2、IL-12、IL-15和IFNα是否可以调节颗粒酶的表达,进而改变NK细胞的细胞毒作用,以及它们的调控模式是否一致等一系列科学问题尚不清楚。为了证明上述问题,我们选用实时定量PCR来检测颗粒酶基因的改变,免疫印迹检测颗粒酶蛋白质水平的表达变化,细胞毒活性确定颗粒酶变化与NK细胞杀伤功能的关系方法1.实时定量PCR检测IL-2、IL-12、IL-15和IFNα对NK-92细胞系表达颗粒酶基因的影响2.蛋白质免疫印迹检测IL-2和IFNα对NK-92细胞系表达颗粒酶B蛋白的影响3.MACS柱分离纯化人外周血NK细胞4.流式细胞术分析人外周血NK细胞的纯度5.小干扰RNA沉默颗粒酶B基因,检测颗粒酶B对NK细胞杀伤功能的影响。6.MTT方法检测NK-92细胞对K562细胞的杀伤作用结果1.IL-2上调NK-92细胞中颗粒酶A和B基因转录水平2.IL-15可以上调NK-92细胞中颗粒酶A和颗粒酶B基因转录水平,下调颗粒酶H基因转录水平3.IL-12提高NK-92细胞中颗粒酶A和B的基因转录水平4.IFNα上调颗粒酶A、B和K的基因转录水平5.IL-2、IL-12、IL-15和IFNα调节NK-92细胞表达颗粒酶的模式不同6.IL-2和IFNα提高NK-92细胞杀伤能力部分依赖于颗粒酶B蛋白表达水平7.IL-2和IFNα上调人外周血分离的NK细胞的颗粒酶B基因表达水平。结论与其它几种颗粒酶相比,颗粒酶B对四种细胞因子的刺激更加敏感,尤其是对于IL-2。IL-15可以上调颗粒酶A和B的表达,下调颗粒酶H的表达。IL-12也可以上调颗粒酶A和B基因水平的表达。不同的是,IFNα可以上调颗粒酶K基因水平的表达。IL-2和IFNα提高NK-92杀伤能力部分依赖于颗粒酶B蛋白表达水平。此外,IL-2和IFNα上调人外周血分离的NK细胞的颗粒酶基因表达水平。总之,尽管IL-2、IL-12、IL-15、IFNα在调节NK细胞表达颗粒酶基因水平上有相似之处,但是它们的作用并不完全一致。它们独特的作用机制可以解释它们对NK细胞不同的调节功能。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 文献综述
• 参考文献
• 前言
• 一、主要实验材料
• 二、主要仪器
• 三、主要实验方法
• 四、实验结果
• 1.半定量PCR对NK-92细胞中颗粒酶的表达水平初步鉴定
• 2.实时定量PCR引物质量鉴定
• 3.IL-2上调NK-92细胞中颗粒酶A和B基因转录水平
• 4.IL-12可以提高NK-92细胞中颗粒酶A和B的基因转录水平
• 5.IL-15可以上调NK-92细胞中颗粒酶A和颗粒酶B基因转录水平,下调颗粒酶H基因转录平
• 6.IFNα上调颗粒酶A、B和K的基因转录水平
• 7.IL-2、IL-12、IL-15和IFNα调节NK-92细胞表达颗粒酶的模式不同
• 8.Western-blot检测IL-2、IFNα对NK-92细胞表达颗粒酶B蛋白水平上的影响
• 9.IL-2、IFNα刺激后对NK-92细胞毒活性的影响
• 10.小干扰RNA沉默颗粒酶B基因后检测NK-92细胞毒活性的变化
• 11.IL-2、IFNα对人外周血分离的的NK细胞颗粒酶A和B基因水平的影响
• 五、讨论
• 附录
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学士论文
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表