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青钱柳悬浮培养细胞三萜酸积累、分离鉴定及其降糖机制研究

2020-12-11阅读(636)

青钱柳悬浮培养细胞三萜酸积累、分离鉴定及其降糖机制研究

论文摘要

青钱柳（Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinsk）为我国特有的胡桃科青钱柳属珍稀濒危植物,零星分布于我国南方各省,可用于保健食品、医药、园林绿化、工业用材等多个领域。研究表明,青钱柳叶含三萜、黄酮、多糖、皂苷及各种微量元素等多种功能活性成分,是具有很高利用价值的天然保健食品资源,但其繁育十分困难,资源稀缺严重制约了其开发利用。本文研究了青钱柳细胞悬浮培养及其三萜酸积累规律,从悬浮培养细胞中提取分离出了主要的三萜酸并进行了结构鉴定,同时对其降糖作用效果及机制进行了研究,旨在探索以青钱柳细胞悬浮培养方式生产三萜酸类降糖功能因子的可行性,为深度开发和利用青钱柳资源、生产三萜酸类降糖功能食品提供理论依据。以青钱柳无菌幼叶诱导愈伤组织,通过长期的筛选和继代培养,获得了疏松易碎、生长旺盛、适合于悬浮培养的优良愈伤组织,转入悬浮培养后,再经反复的筛选、继代和优化培养条件,建立了良好的细胞悬浮培养体系。该培养体系最佳继代时间为接种后第8天,最大细胞干重产量出现在第10天,最高总三萜酸产量出现在第14天。在保持MS培养基中总氮源浓度及铵态氮和硝态氮比例的同时,将磷酸盐、钙离子和镁离子浓度分别调整至1.875 mmol·L-1、2 mmol·L-1和2 mmol·L-1,可获得较高的总三萜酸产量。以三氯化铈和水杨酸对悬浮细胞进行诱导,总三萜酸产量分别可提升35.70%和22.31%。悬浮培养细胞总三萜酸、熊果酸和齐墩果酸产量分别可达1179.85 mg·L-1、443.64 mg·L-1和159.00 mg·L-1。本文首次对青钱柳悬浮培养细胞中的主要三萜酸进行了提取、分离和鉴定。以乙酸乙酯为提取溶剂超声辅助提取悬浮细胞总三萜酸,得率高且杂质少,提取物易于纯化,优化后的主要工艺参数为提取时间40 min、提取温度50℃、料液比1：10,优化条件下总三萜酸提取得率达5.56%。经大孔树脂吸附、硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶层析、半制备高效液相色谱和重结晶等分离纯化,从总三萜酸粗提物中获得了5个单体三萜酸,经HPLC、TLC、RRLC-TOF/MS、1H NMR、13C NMR和DEPT等检测分析,化合物Ⅰ-V分别被鉴定为熊果酸、齐墩果酸、白桦脂酸、2αl-羟基熊果酸、2a-羟基齐墩果酸,其中白桦脂酸和2α-羟基齐墩果酸是首次在青钱柳中得到分离、鉴定。本文以3T3-L1脂肪细胞为模型,在前脂肪细胞、成熟脂肪细胞、胰岛素抵抗脂肪细胞多个层次上进行了青钱柳悬浮培养细胞三萜酸降糖作用效果研究。试验结果表明：（1）TTA（总三萜酸）、UA（熊果酸）、OA（齐墩果酸）、BA（白桦脂酸）、CA（2α-羟基熊果酸）对3T3-L1前脂肪细胞增殖没有促进作用,2.5μg·mL-1 MA（2α-羟基齐墩果酸）有明显的促进作用；（2）TTA、UA、OA、BA对前脂肪细胞葡萄糖消耗没有促进作用,而CA、MA在浓度为2.5至5μg·mL-1时有促进作用,并且在没有胰岛素刺激的情况下也能显著提高葡萄糖消耗；（3）5μg·mL-1的TTA、UA、OA能极显著地促进前脂肪细胞分化,而5μg·mL-1的CA明显地抑制分化,BA和MA则基本无影响；（4）TTA、UA、OA、CA和MA均对成熟脂肪细胞的葡萄糖消耗具有较好的促进作用,且在无胰岛素存在的条件下也能提升葡萄糖消耗,表明三萜酸促进成熟脂肪细胞葡萄糖消耗可能存在与Ros（罗格列酮）不同的作用机制；（5）TTA、UA、MA能防止Dex（地塞米松）所诱导的胰岛素抵抗的形成,OA和CA虽然不能防止胰岛素抵抗形成但能减轻抵抗的程度,而BA对胰岛素抵抗的形成没有影响；（6）TTA和UA能改善已经形成胰岛素抵抗细胞的抵抗状态,具有较好的胰岛素增敏作用,MA、OA、CA也有一定的增敏效果,但BA对抵抗状态没有改善作用；（7）各三萜酸在合适的浓度下,均能显著地减少胰岛素抵抗脂肪细胞培养上清液中的FFA（游离脂肪酸）的含量,这也可能是三萜酸改善胰岛素抵抗、促进葡萄糖消耗的作用机制之一。在全面研究三萜酸降糖作用效果的基础上,选择了效果较好的TTA 7.5μg·mL-1组、UA 5μg·mL-1组、OA 5μg·mL-1组和MA 5μg·mL-1组进行进一步的降糖机制研究,通过检测三萜酸对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞中PPARγ、CAP、Glut4、Resistin和IRS-1五个胰岛素信号传导相关关键靶点的mRNA表达水平,初步探索其作用的分子机理。试验结果表明：（1）UA可能通过两条途径增强胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的胰岛素敏感性、促进葡萄糖消耗：一是上调PPARγ及其下游基因Glut4 mRNA的表达,二是提高IRS-1 mRNA的表达；（2）OA可能是通过下调Resistin mRNA的表达来发挥降糖作用；（3）MA可能通过提高胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞CAP和IRS-1 mRNA的表达来增强胰岛素敏感性、促进葡萄糖消耗,虽然MA没有表现出促进PPARγmRNA表达的活性,但还是明显促进了CAP mRNA的表达,提示CAP的表达除受PPARγ调控之外还可能存在其它调控途径；（4）TTA为各三萜酸的混合物,其降糖作用的效果和机制基本上是各三萜酸作用的综合体现,一是通过促进PPARγmRNA的表达来提高其下游CAP、Glut4 mRNA的表达；二是上调IRS-1 mRNA的表达；（5）青钱柳三萜酸在改善胰岛素抵抗、促进葡萄糖消耗上存在与Ros不一样的作用机制。综上所述可得出如下结论：（1）青钱柳悬浮培养细胞中含熊果酸、齐墩果酸、白桦脂酸、2α-羟基熊果酸、2α-羟基齐墩果酸五种主要的三萜酸；（2）青钱柳细胞悬浮培养可用于熊果酸、齐墩果酸等三萜酸的生产；（3）青钱柳悬浮培养细胞三萜酸具有较好的降糖作用效果；（4）青钱柳悬浮培养细胞三萜酸可通过提升PPARy、CAP、Glut4、IRS-1 mRNA的表达、下调Resistin mRNA的表达水平来实现降糖作用。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 引言
  • 1.1 概述
  • 1.2 青钱柳的主要活性成分
  • 1.2.1 三萜化合物
  • 1.2.2 黄酮化合物
  • 1.2.3 多糖
  • 1.2.4 其它活性成分
  • 1.3 青钱柳的主要功能作用
  • 1.3.1 降血糖
  • 1.3.2 降血脂
  • 1.3.3 降血压
  • 1.3.4 增强免疫
  • 1.3.5 抗氧化与防衰老
  • 1.4 植物细胞培养与次生代谢产物生产
  • 1.4.1 植物细胞培养的概况
  • 1.4.2 植物细胞培养生产次生代谢产物现状
  • 1.4.3 植物细胞培养生产次生代谢产物的优势及问题
  • 1.5 青钱柳组织培养与次生代谢产物生产
  • 1.6 糖尿病与胰岛素信号转导
  • 1.6.1 胰岛素信号转导途径
  • 1.6.2 胰岛素信号转导关键靶点
  • 1.6.3 胰岛素抵抗细胞模型
  • 1.7 本课题研究的目的、意义及主要内容
  • 1.7.1 课题来源
  • 1.7.2 研究价值和意义
  • 1.7.3 研究的技术路线
  • 1.7.4 主要研究内容
  • 第2章 青钱柳细胞悬浮培养及三萜酸积累
  • 2.1 引言
  • 2.2 试验材料与设备
  • 2.2.1 原料
  • 2.2.2 试剂
  • 2.2.3 标准品
  • 2.2.4 实验仪器
  • 2.3 试验方法
  • 2.3.1 愈伤组织的继代培养及改良
  • 2.3.2 悬浮培养细胞系的初步建立
  • 2.3.3 悬浮培养细胞生长曲线及总三萜酸积累曲线的建立
  • 2.3.4 宏量元素对总三萜酸产量的影响
  • 2.3.5 诱导子三氯化铈和水杨酸对总三萜酸产量的影响
  • 2.3.6 总三萜酸的提取及测定
  • 2.3.7 熊果酸和齐墩果酸测定
  • 2.3.8 总三萜酸薄层层析方法
  • 2.3.9 悬浮培养细胞鲜、干重测定
  • 2.4 数据分析及计算
  • 2.5 结果与分析
  • 2.5.1 愈伤组织的诱导、继代培养及优良愈伤组织的获得
  • 2.5.2 细胞悬浮培养体系的建立
  • 2.5.3 悬浮培养细胞生长曲线及总三萜酸积累曲线的建立
  • 2.5.4 宏量元素对总三萜酸产量的影响
  • 2.5.5 诱导子三氯化铈和水杨酸对总三萜酸产量的影响
  • 2.5.6 悬浮培养细胞、愈伤组织和叶片总三萜酸比较
  • 2.6 讨论
  • 2.6.1 愈伤组织的改良
  • 2.6.2 建立悬浮培养细胞系的关键
  • 2.6.3 培养基中宏量元素的调整
  • 2.6.4 稀土元素铈和水杨酸对次级代谢的促进作用
  • 2.6.5 青钱柳细胞悬浮培养生产三萜酸的可行性
  • 2.7 小结
  • 第3章 青钱柳悬浮培养细胞三萜酸提取分离及结构鉴定
  • 3.1 引言
  • 3.2 试验材料与设备
  • 3.2.1 原料
  • 3.2.2 试剂
  • 3.2.3 实验仪器
  • 3.3 试验方法
  • 3.3.1 总三萜酸提取
  • 3.3.2 三萜酸分离纯化流程
  • 3.3.3 RRLC-TOF/MS检测
  • 3.3.4 半制备高效液相色谱分离
  • 3.4 数据分析及计算
  • 3.5 结果与分析
  • 3.5.1 总三萜酸的提取
  • 3.5.2 化合物Ⅰ-Ⅴ纯度鉴定
  • 3.5.3 化合物Ⅰ-Ⅴ结构鉴定
  • 3.6 讨论
  • 3.6.1 总三萜酸的提取
  • 3.6.2 总三萜酸的大孔树脂及凝胶纯化
  • 3.6.3 总三萜酸的鉴定
  • 3.7 小结
  • 第4章 青钱柳悬浮细胞三萜酸降糖作用研究
  • 4.1 引言
  • 4.2 试验材料与设备
  • 4.2.1 材料
  • 4.2.2 试剂
  • 4.2.3 实验仪器
  • 4.3 试验方法
  • 4.3.1 研究路线
  • 4.3.2 试剂配制
  • 4.3.3 3T3-L1前脂肪细胞复苏
  • 4.3.4 3T3-L1前脂肪细胞培养及传代
  • 4.3.5 3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化
  • 4.3.6 成熟脂肪细胞的鉴定
  • 4.3.7 三萜酸对脂肪细胞增殖、分化及葡萄糖消耗的影响
  • 4.3.8 葡萄糖消耗检测
  • 4.3.9 细胞内甘油三酯检测
  • 4.3.10 培养上清液游离脂肪酸测定
  • 4.4 数据分析及计算
  • 4.5 结果与分析
  • 4.5.1 三萜酸对前脂肪细胞增殖的影响
  • 4.5.2 三萜酸对前脂肪细胞葡萄糖消耗的影响
  • 4.5.3 三萜酸对前脂肪细胞分化的影响
  • 4.5.4 三萜酸对成熟脂肪细胞葡萄糖消耗的影响
  • 4.5.5 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立
  • 4.5.6 三萜酸对脂肪细胞胰岛素抵抗形成的影响
  • 4.5.7 三萜酸对胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖消耗的影响
  • 4.5.8 三萜酸对胰岛素抵抗细胞游离脂肪酸释放的影响
  • 4.6 讨论
  • 4.6.1 前脂肪细胞增殖、分化与降糖作用的关系
  • 4.6.2 检测三萜酸对前脂肪细胞分化影响的时间选择
  • 4.6.3 三萜酸在增进葡萄糖消耗及胰岛素敏感性上的差异分析
  • 4.6.4 游离脂肪酸的释放与胰岛素抵抗
  • 4.7 小结
  • 第5章 三萜酸改善胰岛素抵抗的作用机制
  • 5.1 引言
  • 5.2 试验材料与设备
  • 5.2.1 原料
  • 5.2.2 试剂
  • 5.2.3 实验仪器设备
  • 5.3 试验方法
  • 5.3.1 主要试剂配制
  • 5.3.2 试验分组设置
  • 5.3.3 细胞总RNA提取
  • 5.3.4 总RNA纯度鉴定及定量
  • 5.3.5 第一链cDNA合成
  • 5.3.6 PCR反应体系及程序
  • 5.3.7 凝胶成像及数据分析
  • 5.4 数据分析及计算
  • 5.5 结果与分析
  • 5.5.1 三萜酸对胰岛素抵抗脂肪细胞PPARγmRNA表达的影响
  • 5.5.2 三萜酸对胰岛素抵抗脂肪细胞CAP mRNA表达的影响
  • 5.5.3 三萜酸对胰岛素抵抗脂肪细胞Glut4 mRNA表达的影响
  • 5.5.4 三萜酸对胰岛素抵抗脂肪细胞Resistin mRNA表达的影响
  • 5.5.5 三萜酸对胰岛素抵抗脂肪细胞IRS-1 mRNA表达的影响
  • 5.6 讨论
  • 5.6.1 降糖试验模型的选择
  • 5.6.2 作用靶点的选择
  • 5.6.3 PPARγ激活与降糖
  • 5.6.4 青钱柳三萜酸降糖作用机制探讨
  • 5.7 小结
  • 第6章 结论与展望
  • 6.1 结论
  • 6.1.1 青钱柳细胞悬浮培养及三萜酸积累
  • 6.1.2 青钱柳悬浮培养细胞三萜酸提取分离与结构鉴定
  • 6.1.3 青钱柳悬浮细胞三萜酸降糖作用研究
  • 6.1.4 青钱柳悬浮细胞三萜酸改善胰岛素抵抗的作用机制
  • 6.2 进一步研究的方向
  • 创新之处
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录A:附图
  • 攻读学位期间的研究成果

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