兔出血热病毒重组疫苗的构建与筛选

论文摘要

兔出血症是由兔出血症病毒所致的一种急性、高致死性传染疾病,以全身实质器官水肿、出血性变化及淤血为主要特征。该病首先于1984年在我国爆发,随后迅速蔓延到世界各地,感染兔出血热病毒RHDV的兔子常在48-72小时内死亡。RHDV病毒粒子呈球形,无囊膜,直径32-36nm,20面体对称。其基因组为单股正链RNA,全长7437bp,有两个开放阅读框。ORF1占整个基因组的94%,编码一个进一步分解为结构蛋白和非结构蛋白的多聚蛋白。其中衣壳蛋白为主要的结构蛋白（5305-7041nt）,称为VP60。兔黏液瘤病（Myxomatosis）和RHD一样是严重影响欧洲兔群的两大疾病。其中MV为专一感染兔的痘病毒。该病毒属于痘病毒科,野兔痘病毒属,痘病毒含有能够被真核细胞识别的启动子,这些启动子不但可以启动基因工程中常用的一些标记基因的表达,而且还能够引发克隆的外源基因的表达。痘病毒经过改建后,可以发展成为表达外源基因的分子载体。本研究用兔粘液瘤病毒作为重组病毒载体,以粘液瘤病毒的非必须基因MST3N基因为同源重组位点,通过同源重组,制备能同时抵抗兔出血热病毒和粘液瘤病毒两种病毒的重组疫苗。这种重组疫苗表达兔出血热病毒RHDV的主要衣壳蛋白VP60和筛选标记GFP。通过筛选标记GFP在荧光下筛选重组病毒,经过几轮空斑筛选,分离纯化重组病毒。与野生型病毒相比,MST3N基因被敲断了的重组病毒在RK13细胞中的复制并未受到影响。皮下注射重组病毒疫苗后,被注射兔子血清内产生了RHDV抗体,并且能抵御毒力最强的粘液瘤病毒毒株的攻击。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一、引言
• 1.1 兔出血热病毒简介
• 1.1.1 兔出血热病毒RHDV简介
• 1.1.2 兔出血症在各地的爆发
• 1.1.3 兔出血症病症差异
• 1.1.4 兔出血热病毒RHDV的分类,基因组,及病毒粒子
• 1.2 兔粘液瘤病毒MV介绍
• 1.2.1 兔粘液瘤病毒的感染特性
• 1.2.2 兔粘液瘤病毒的分类及性质
• 1.3 以痘病毒为载体的重组病毒的研究
• 1.4 非必需基因MST3N
• 1.5 研究目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验仪器和设备
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要实验耗材
• 2.2.2 细胞和病毒
• 2.2.3 菌株和质粒
• 2.2.4 引物
• 2.2.5 常用试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 从病毒液中提取病毒DNA
• 2.3.2 大肠杆菌质粒DNA提取
• 2.3.3 大肠杆菌转化
• 2.4 基因的PCR扩增
• 2.5 DNA沉淀
• 2.6 DNA去磷酸化
• 2.7 DNA体外连接反应
• 2.8 琼脂糖凝胶电泳
• 2.9 纯化PCR产物
• 2.10 细胞培养及相关操作
• 2.10.1 空斑实验测定病毒滴度
• 2.10.2 转染
• 2.10.3 重组病毒的筛选
• 2.10.4 重组病毒的纯化
• 2.10.5 重组病毒的扩大及鉴定
• 2.11 ELISA测定抗体效价
• 第三章 结果与分析
• 3.1 重组质粒的构建
• 3.1.1 构建重组质粒两边的同源重组区
• 3.1.2 以pMVP60-UP-DOWN为载体构建含有GFP筛选标记的重组质粒
• 3.2 适宜毒力的载体病毒的选择
• 3.2.1 动物实验检验不同毒株粘液瘤病毒毒力
• 3.2.2 不同毒株粘液瘤病毒滴度测定
• 3.2.3 家兔皮下注射
• 3.2.4 症状观察,拍照,记录,总结
• 3.3 重组病毒的筛选
• 3.3.1 重组质粒的转染及转染效率的测定
• 3.3.2 重组病毒的筛选及纯化
• 3.4 重组病毒的鉴定
• 3.4.1 重组病毒的PCR验证
• 3.4.2 重组病毒的Western-blot验证
• 3.5 重组病毒的毒力对比实验
• 3.6 重组病毒疫苗的病毒保护试验
• 3.7 重组病毒疫苗抗体效价测试
• 第四章 讨论与展望
• 4.1 结果讨论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 本文缩写词
• 致谢