富钼酿酒酵母的单倍体和原生质体复合诱变选育及其生物学功能研究

论文摘要

钼（Molybdenum,Mo）是动物、微生物及人体所必需的微量营养元素之一,是固氮酶、硝酸还原酶、黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、亚硫酸氧化酶等多种酶的重要组成成分,参与并影响机体内的多种代谢过程,如参与细胞内电子转运、机体内铁从铁蛋白的释放及铁的运输、醛氧化等。钼与乳腺癌、食道癌、心脑血管疾病、肝脏疾病、克山病、龋齿、小细胞低色素性贫血症等病症密切相关。利用酵母富集转化钼具有结合率、利用率高和安全性好等特点,因此富钼酵母作为机体钼源的补充,尤其是作为预防和治疗癌症、心脑血管疾病和肝脏疾病药物的重要功效成分引起了人们的极大重视。本实验旨在通过诱变选育富钼能力强的菌株,分析其生物学功能和黄嘌呤氧化酶、硝酸还原酶等酶活性,为富钼酵母的生产应用奠定基础。对十株二倍体酵母菌株进行钼酸钠液体抗性检测后,筛选出一株钼抗性高的二倍体酿酒酵母菌株Y1,其Na2MoO4抗性水平为20 mmol/L。通过Y1单倍体分离,并进行液体抗性水平检测,获得高抗单倍体菌株,将其与单倍体菌株SY10、SY11、SY12和SY14进行不同终浓度的钼酸钠液体抗性水平检测,筛选得到高抗单倍体菌株SY10（Na2MoO4抗性70 mmol/L）,将其作为出发菌株。以蜗牛酶酶解SY10制备原生质体,并对其原生质体和单倍体菌株进行紫外线诱变,最佳照射时间分别为4 min和3 min。通过抗性水平检测获得了2株诱变菌株SY10-186p和SY10-150s（Na2MoO4抗性分别为300 mmol/L和350 mmol/L）,其拮抗Na2MoO4浓度分别为出发菌株的4.29倍和5.0倍。分别将SY10-186p的原生质体和SY10-150s的单倍体进行紫外线再次诱变,最佳照射时间分别为4 min和6 min。通过抗性水平检测获得了2株诱变菌株SY10-186p-216u和SY10-150s-208u（Na2MoO4抗性均为400 mmol/L）,其拮抗Na2MoO4浓度均为出发菌株的5.71倍,生物量分别为4.575 g/L和1.610 g/L,是出发菌株的1.75倍和1.94倍。通过原子吸收光谱法测定其钼含量分别为38.52 mg/L和43.95 mg/L,为出发菌株的4.86倍和5.55倍。用电感耦合等离子体发射光谱法测定其有机钼元素含量分别为15.87 mg/L和14.20 mg/L,为出发菌株的31.74倍和28.40倍。分别将SY10-186p的原生质体和SY10-150s菌株的单倍体进行微波复合诱变,微波源为2450 MHz,功率为850 W,最佳照射时间均为5 s。通过抗性水平检测获得了2株复合诱变菌株SY10-186p-8m和SY10-150s-48m（Na2MoO4抗性均为400 mmol/L）,其拮抗Na2MoO4浓度均为出发菌株的5.71倍,生物量为3.725 g/L和2.210 g/L,分别是出发菌株的1.42倍和2.66倍。通过原子吸收光谱法测定其总钼含量分别为39.13 mg/L和40.05 mg/L,为出发菌株的4.94倍和5.06倍。电感耦合等离子体发射光谱法测定其有机钼元素含量分别为15.08 mg/L和17.24 mg/L,为出发菌株的30.16倍和34.48倍。诱变菌株SY10-186p-216u、SY10-150s-208u、SY10-186p-8m和SY10-150s-48m的黄嘌呤氧化酶和硝酸还原酶的活性提高,分别为7.679 U/L、7.380 U/L、7.679 U/L、8.876 U/L和0.784 U/L、1.040 U/L、0.525 U/L、0.691U/L,是出发菌株的15.42倍、14.82倍、15.42倍、17.82倍和2.12倍、2.81倍、1.42倍、1.87倍。在非重金属选择压力下,50世代的遗传稳定性检测表明,4株诱变菌株SY10-186p-216u、SY10-150s-208u、SY10-186p-8m和SY10-150s-48m的遗传稳定性均保持在90 %以上。生物学功能检测结果表明,诱变菌株SY10-186p-216u、SY10-150s-208u、SY10-186p-8m和SY10-150s-48m拮抗紫外线（UV）能力均明显高于出发菌株SY10。它们清除羟基自由基以及超氧阴离子自由基的能力也明显提高,分别达到67.26 %、73.08 %、76.55 %、62.66 %和39.8 %、41.1 %、40.5 %、43.9 %,是出发菌株的6.34倍、6.89倍、7.22倍、5.91倍和3.09倍、3.26倍、3.21倍、3.48倍。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 钼的组织分布、代谢及人体需求量
• 1.2 钼酶的生理功能
• 1.2.1 固氮酶
• 1.2.2 黄嘌呤氧化酶
• 1.2.3 亚硫酸盐氧化酶
• 1.2.4 醛氧化酶
• 1.2.5 硝酸盐还原酶
• 1.3 钼与其他微量元素之间的相互作用
• 1.3.1 钼与硫
• 1.3.2 钼与钨
• 1.3.3 钼与铜
• 1.3.4 钼与硒
• 1.3.5 钼、硫与镉
• 1.3.6 钼、硫与铜
• 1.4 钼对人类健康的影响
• 1.4.1 保护心肌
• 1.4.2 维持动脉的弹性
• 1.4.3 抑制癌症的发生
• 1.4.4 钼与动物骨、关节异常的关系
• 1.4.5 钼与动物甲状腺的功能的关系
• 1.4.6 钼具有提高机体免疫能力和促进生长的作用
• 1.4.7 参与电子的传递及铁从铁蛋白的释放及铁的运输
• 1.4.8 钼与人的发生、发育、成熟可能有一定关系
• 1.4.9 Mo 可预防痛风和肾结石的发生
• 1.4.10 其它作用
• 1.5 钼缺乏和钼过量可能引起的疾病
• 1.5.1 钼缺乏引起的疾病
• 1.5.2 钼过量引起的疾病
• 1.6 酵母富集微量元素的概况
• 1.7 酵母富集微量元素的途径
• 1.7.1 生物吸附
• 1.7.2 主动运输
• 1.8 酵母作为微量元素载体的优点
• 1.9 钼元素的测定方法
• 1.9.1 催化极谱法
• 1.9.2 分光光度法
• 1.9.3 原子吸收光谱法
• 1.9.4 等离子发射光谱分析
• 1.10 富钼微生物的应用前景
• 1.10.1 食品工业
• 1.10.2 预防医学
• 1.10.3 畜牧业
• 1.11 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基与渗稳剂
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 单倍体分离及倍性鉴定
• 2.2.2 单倍体液体抗性水平检测
• 2.2.3 原生质体制备与再生
• 2.2.4 原生质体与单倍体紫外线诱变
• 2.2.5 原生质体与单倍体紫外线复合诱变
• 2.2.6 原生质体与单倍体微波复合诱变
• 2.2.7 细胞生物量测定
• 2.2.8 粗提取液的制备和有机钼含量测定
• 2.2.9 总钼含量的测定
• 2.2.10 液体抗性水平检测
• 2.2.11 诱变菌株生物学功能测定
• 2.2.12 遗传稳定性检测
• 3 结果与分析
• 3.1 单倍体制备及诱变出发菌株的获得
• 3.2 原生质体以及单倍体紫外线诱变
• 3.2.1 不同剂量紫外线对原生质体以及单倍体的诱变效果
• 3.2.2 紫外诱变菌株液体抗性水平检测
• 3.3 原生质体以及单倍体紫外线复合诱变
• 3.3.1 不同剂量紫外线对原生质体以及单倍体的诱变效果
• 3.3.2 紫外复合诱变菌株液体抗性水平检测
• 3.4 原生质体以及单倍体微波复合诱变
• 3.4.1 不同剂量微波辐射对原生质体以及单倍体的诱变效果
• 3.4.2 微波诱变菌株液体抗性水平检测
• 3.5 总钼含量测定
• 3.6 有机钼含量测定
• 2MoO₄ 液体抗性水平检测'>3.7 Na₂MoO₄液体抗性水平检测
• 3.8 诱变菌株的生物学功能
• 3.8.1 拮抗紫外线辐射效应
• 3.8.2 清除·OH 自由基能力比较
• 2^·-自由基能力比较'>3.8.3 清除O₂^·-自由基能力比较
• 3.8.4 黄嘌呤氧化酶的活性的测定
• 3.8.5 硝酸还原酶的活性的测定
• 3.9 遗传稳定性检测
• 4 讨论
• 4.1 单倍体分离与原生质体的制备及再生
• 4.2 原生质体紫外线与微波复合诱变选育
• 4.3 富钼酵母生物学功能的检测
• 4.4 创新之处
• 4.5 尚待进一步开展的工作
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 致谢
• 8 攻读学位期间发表论文情况