中慢生型天山根瘤菌CCBAU060A群体感应系统和其调控基因的研究及其对共生结瘤的影响

论文摘要

目前在根瘤菌这一类能与豆科植物结瘤固氮的细菌中发现的群体感应信号分子绝大多数为酰基高丝氨酸内酯类化合物。根瘤菌的群体感应系统在其与宿主豆科植物成功建立共生关系的过程中,可以对根瘤菌的不同生理功能如结瘤效率、生长速度、胞外多糖的产生以及固氮效率等起着重要作用。本实验室前期的研究发现中慢生型天山根瘤菌CCBAU3306存在群体感应现象,该信号传递系统在中慢生型天山根瘤CCBAU3306与其宿主植物甘草的结瘤固氮中起着重要的作用。本研究首先针对中慢生型天山根瘤菌种内不同菌株产生群体感应信号分子的能力进行了检测,发现它们产生自体诱导物信号分子的种类极具多样性。其中CCBAU060A产生自体诱导物分子的种类与模式菌株CCBAU3306最为不同。通过构建M.tianshanense CCBAU060A转座子随机突变文库,从5,000个随机突变株中筛选得到了六株自体诱导物活性降低的突变株。应用Arbitary PCR及亚克隆的方法确定了突变株中转座子的插入位点及其插入基因的完整序列,经GeneBank序列同源性比对发现:HJC4转座子插入一个含有657bp碱基编码自体诱导物合成酶基因的ORF中,而HJC3与HJC5的转座子则以不同方向插入其上游的一个LuxR家族转录调控基因中,这两个基因被分别命名为mtqI和mtqR。构建mtqI-lacZ及mtqR-lacZ的融合菌株,检测了在有AHL和没有AHL的情况下,报告基因lacZ的表达情况。结果显示,mtqI,基因的表达随着茵体浓度,即AHL的浓度的增加而增强,而在没有AHL的时候mtqI-lacZ只在本底水平表达,说明CCBAU060A中mtqI的表达是受其自身产物信号分子诱导的。在缺失mtqR的菌株中,无论有否添加外源AHL,mtqI-lacZ均不表达,说明mtqI是受到mtqR基因调控的。同样在mtqS突变株即另一株自体诱导物合成缺失突变株中,无论是否添加外源AHL,mtqI-lacZ均不能被诱导,这与之前我们在mtqR突变株中测定的结果一样,且在mtqS突变菌株中超表达mtqR后,AHL的活性也得到了回复,说明mtqS基因是通过调控mtqR基因的表达来调控mtqR/mtqI群体感应调控系统。初步研究了mtqR/mtqI群体感应系统对M.tianshanense CCBAU060A生理功能的影响。无论是mtqR基因或是mtqI基因的突变都对菌株的生长速率产生了影响,使得细菌的对数生长期延长,尤其是mtqS基因的突变,这种延长更为明显。mtqI基因的突变还延迟了菌株与宿主植物甘草的结瘤过程,推测mtqI基因对于根瘤菌与其宿主植物之间的信号识别过程有一定的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 文献综述
• 1 细菌的群体感应调控系统
• 1.1 细菌感知种内数量的群体感应系统
• 1.2 细菌感知种间数量的群体感应系统
• 2 细菌的群体感应信号分子
• 2.1 环境对信号分子产生的影响
• 2.2 信号分子的检测
• 2.3 信号分子的纯化、性质分析与鉴定
• 3 根瘤菌与群体感应
• 3.1 豆科植物—根瘤菌相互识别的分子机制
• 3.2 根瘤菌分类研究的现状
• 3.3 根瘤菌中的群体感应系统
• 3.4 慢生大豆根瘤菌中独特的群体感应调节
• 3.5 中慢生型根瘤菌属群体感应的研究
• 4 本研究的目的和意义
• 第一章 中慢生型天山根瘤菌种内菌株自体诱导物活性的检测
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 M.tianshanense种内不同菌株的AHL活性检测
• 2.2 M.tianshanense CCBAU060A自体诱导物活性测定
• 2.3 M.tianshanense CCBAU060A自体诱导物分子性质的初步分析
• 2.4 AHL结构的质谱分析
• 3 总结与讨论
• 第二章 中慢生型天山根瘤菌CCBAU060A自体诱导物合成缺失突变株的筛选及其相关基因的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 自体诱导物合成缺失突变株的筛选
• 2.2 自体诱导物合成酶基因及其相关基因的鉴定
• 3 总结与讨论
• 第三章 中慢生型天山根瘤菌CCBAU060A自体诱导物合成酶及其相关基因的表达调控
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 mtqI基因的表达与调控
• 2.2 mtqR基因的表达与调控
• 2.3 mtqS基因的表达与调控
• 2.4 突变株的基因互补实验
• 3 总结与讨论
• 第四章 中慢生型天山根瘤菌CCBAU060A群体感应系统对其生长和共生结瘤的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 mtqR/mtqI群体感应系统对菌株生长速率的影响
• 2.2 mtqI基因缺失对菌株结瘤的影响
• 2.3 根瘤中根瘤菌数目和AHL的含量测定
• 3 总结与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录一 ESI MS/MS图谱
• 附录二 本文所用培养基与试剂配方
• 附录三 本文克隆基因序列
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢