论文摘要
中波紫外线（ultraviolet B,UVB）可诱导皮肤肿瘤发生,又可诱导人皮肤成纤维细胞（humn skin fibroblast,HSF）发生应激诱导的提前衰老（stressinducedpremature senescence,SIPS）。目前认为细胞衰老是抑制肿瘤发生的机制之一,抑癌基因p53是其中关键的调控因子,但是在UVB诱导的细胞衰老中未见报道,因此,研究p53在UVB诱导的提前衰老中的调控作用和肿瘤抑制作用具有重要的意义。本研究分四个部分探讨了UVB照射诱导HSF发生SIPS中p53的调控作用及肿瘤抑制作用。研究目的:第一部分探讨中波紫外线（UVB）诱导人皮肤成纤维细胞（HSF）衰老与UVB辐射剂量的关系,建立UVB诱导的成纤维细胞早衰模型,为深入研究UVB诱导的细胞衰老与肿瘤发生的关系奠定基础。第二部分探讨UVB诱导SIPS后细胞周期调控的变化。探讨p53相关的生长停滞、细胞凋亡和肿瘤发生相关基因表达在UVB诱导的SIPS中的变化情况。初步探讨UVB诱导SIPS在肿瘤发生机制中的作用。第三部分,转染针对p53的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）质粒建立抑制p53表达的HSF细胞系。探讨抑制p53表达对UVB诱导HSF发生SIPS及其肿瘤抑制作用的影响。第四部分建立稳定过表达野生型p53基因（wtp53）的人皮肤成纤维细胞系。探讨过表达p53对UVB诱导SIPS及其肿瘤抑制作用的影响。研究方法:1.以亚毒性剂量UVB反复照射HSF以诱导其衰老。2.衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase,SAβ-gal）染色法检测照射后细胞的SAβ-gal活性。3.四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT法）检测HSF经UVB辐射后的细胞增殖情况。4.逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chainraction,RT-PCR）检测三种衰老相关基因即纤维结合素（fibronectin,FN）,骨结合素（osteonectin,ON）和平滑肌22（smooth muscle 22,SM22）基因的表达。5.流式细胞仪检测细胞周期。6.蛋白印迹法（western blot,WB）检测细胞周期蛋白p53、p21、p16的表达。7.实时荧光定量PCR芯片的方法检测与p53相关的生长停滞,凋亡及肿瘤发生相关的基因的mRNA表达水平。包括p53、p21、p16、p19、bax、bcl-2、缺氧诱导因子1α（hypoxia-induciblefactor 1 alpha subunit,HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor,VEGF）、人双微球蛋白2基因（human double minute 2,hdm2）等。8.在脂质体lipofectamineTM2000介导下,分别将p53的shRNA的真核表达质粒pGCsi-p53和含有野生型p53的真核表达质粒pCMV-p53导入HSF中,经G418筛选抗性克隆,扩大培养,建立稳定转染克隆细胞系。用RT-PCR、WB和实时定量PCR分析目的基因及其蛋白表达。9.建立的抑制p53表达和p53过表达的HSF模型分别在UVB照射后进行SAβ-gal染色、MTT法、实时荧光定量PCR芯片测定。研究结果:第一部分:筛选出适宜的诱导衰老的剂量和次数,以10 mJ/cm2的亚毒性UVB剂量连续5次照射HSF后,衰老的生物学特征得以明显表现,包括细胞生长停滞,SAβ-gal活性,衰老相关基因的表达等。在建立的衰老模型中,第一,MTT法检测显示了细胞增生能力的减弱;第二,具有SAβ-gal活性的阳性细胞明显增加;第三,三种衰老相关基因,FN,ON和SM22的表达亦明显增强。第二部分:流式细胞仪对UVB诱导的SIPS模型进行细胞周期检测发现,大部分细胞发生了G1期阻滞;衰老通路中p53,p21和p16的表达都明显增加;实时荧光定量PCR芯片检测发现,与生长停滞相关的抑癌基因p53、p21、p16、p19的表达均上调;p53下游的凋亡相关基因中的抑凋亡基因bcl-2表达稍上调,而凋亡基因bax表达下调;在肿瘤发生相关基因中,癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2的表达均下调。第三部分:成功建立RNA干扰抑制p53表达的HSF细胞系,转染细胞中p53基因及蛋白水平明显下调。抑制p53表达的细胞株经UVB照射后SAβ-gal活性降低,具有抑制UVB诱导的细胞生长停滞的作用。肿瘤发生相关基因检测结果表明抑制p53表达可抑制衰老基因的表达,但p16通路并不受之影响,在UVB作用下仍可发挥作用。抑制p53的表达可使抑凋亡基因bcl-2上调及促凋亡基因bax下调,癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2表达明显增加。这些p53依赖的细胞凋亡和抑制肿瘤作用被抑制。UVB照射与否对这两种作用无明显影响。第四部分:成功建立过表达p53的HSF细胞系,转染细胞中存在p53基因及蛋白的稳定过表达。过表达p53的细胞株经UVB照射后SAβ-gal活性未见增高,对UVB诱导的细胞生长停滞的影响并不显著。肿瘤发生相关基因检测结果表明过表达p53未能提高衰老基因的表达;过表达p53可使抑凋亡基因bcl-2下调及促凋亡基因bax上调;癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2表达明显降低。这些p53依赖的细胞凋亡和抑制肿瘤作用因p53的过表达而更为显著。UVB照射可加强这两种作用。结论:第一部分:反复亚毒性剂量UVB照射HSF可诱导其SIPS发生,表现出与复制衰老（RS）的成纤维细胞许多共同的特征。实验成功建立了一种UVB诱导的HSF的SIPS模型,可用于进一步的相关研究。第二部分:G1期阻滞和衰老信号通路蛋白表达增加进一步印证了UVB诱导HSF发生的SIPS。p53信号通路相关基因的表达变化提示UVB诱导的SIPS可能具有与p53相关的抗凋亡和肿瘤抑制的作用,但其中p53信号通路所起的作用还需更进一步的实验探索。第三部分:抑制p53表达能够延迟或部分抑制HSF的复制衰老和UVB诱导的SIPS。UVB诱导的SIPS中的部分肿瘤抑制机制确由p53所调控,抑制p53表达可使部分p53依赖的细胞凋亡和抑制肿瘤作用明显缺失,从而有助于肿瘤的发生。第四部分:过表达p53不能促进HSF的复制衰老和UVB诱导的SIPS。过表达p53可使p53依赖的细胞凋亡和抑制肿瘤作用明显增强,UVB还可加强这种作用,从而有助于抑制肿瘤发生。在UVB作用下,过表达p53可能更倾向于诱导凋亡而非衰老。
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