猪ACTN3基因功能的初步研究

论文摘要

近年来,本实验室利用抑制消减杂交技术、mRNA差异显示技术、基因芯片和蛋白质组学技术筛选出大量的在猪中差异表达的基因,还有待进行进一步的验证。ACTN3基因是我室利用蛋白质组学技术筛选鉴定出来的在梅山猪背最长肌中不同时期差异表达的基因之一,本研究对该基因作了进一步研究,取得的结果如下：1.获得猪ACTN3基因整合cDNA全长2875bp,共21个外显子,其中ORF为2709bp,编码902个氨基酸,还获得部分基因组DNA序列5176bp,并分析了其基因结构,其内含子和外显子的剪切方式都符合GT-AG规则。2.通过生物信息学方法对ACTN3基因的基因结构、所编码的蛋白质结构以及功能等特征进行了预测和分析,并构建了分子系统进化树。3.运用半定量RT-PCR技术对ACTN3基因进行了组织表达谱分析,结果表明：ACTN3在脂肪、背最长肌、股二头肌、半腱肌、咬肌五个组织中高表达,在肺里有较低表达,在肝脏中微弱表达,在其他组织中（心、脾、肾、胃、睾丸）几乎不表达。4.运用实时定量PCR技术对ACTN3基因在大白、梅山猪背最长肌中进行了时空表达谱分析,结果表明：ACTN3基因在大白猪、梅山猪出生后3d、21d、60d、120d、180d这五个时期均有表达。大白猪中,ACTN3的表达量从出生后3d到60d,逐渐增加达到恒定,直到180d,基本保持不变；梅山猪中,从出生后3d到21d,,ACTN3的表达量增加且达到最大值,之后到120d持续下降,到180d时有所增加。ACTN3的表达量在梅山猪中3d和21d两个时期间差异显著（P<0.05）,在大白猪中时期差异不显著。5.对ACTN3基因的2个SNP位点在不同猪品种中进行了基因频率和基因型频率检测,并在2003年和2004年大白×梅山猪F2代资源家系中与肉质性状、胴体性状进行了相关分析,结果表明：在肉质性状方面,第11外显子G418A位点（PCR-TspEⅠ-RFLP）与系水力、股二头肌大理石纹评分和肌内水分显著相关（P<0.05）,第19内含子A512G位点（PCR-SacⅡ-RFLP）与股二头肌pH、头半棘肌pH显著相关（P<0.05）；在胴体性状方面,G418A位点与肥肉率、屠宰率、6-7腰椎间背膘厚、胸腰椎间背膘厚极显著相关（P<0.01）,与平均背膘厚和肥瘦肉比例显著相关（P<0.05）；A512G位点与屠宰率、6-7腰椎间背膘厚、平均背膘厚极显著相关（P<0.01）,与胸腰椎间背膘厚、臀部平均背膘厚、肥瘦肉比例、眼肌高呈显著相关（P<0.05）。6.采用PCR方法扩增了ASTN3基因5’侧翼1724bp的序列,利用生物信息学方法预测了猪ACTN3基因的核心启动子区、转录起始位点、CpG岛的分布及转录因子结合位点。7.结合启动子区预测结果,采用5’端系统缺失的方法,成功构建了8个猪ACTN3基因启动子区的重组表达载体,并转染猪PK15细胞,利用双荧光素酶报告基因系统检测了它们的活性,结果表明：构建的8个重组子的荧光素酶活性与阴性对照相比均达到显著水平（P<0.05）,表明它们均具有启动子活性。从pGL-ACTN395至pGL-ACTN696、pGL-ACTN1077到pGL-ACTN1410,活性均有所下降,表明这些区域可能存在负的调控位点,从pGL-ACTN696到pGL-ACTN1077活性逐步升高,且达到最大值,表明该区域可能存在正的调控位点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.α辅肌动蛋白ACTN3的研究进展
• 1.1 α辅肌动蛋白的分类
• 1.2 α辅肌动蛋白的结构
• 1.3 α辅肌动蛋白的分子生物学功能
• 1.4 ACTN3基因
• 1.4.1 不同物种ACTN3基因的定位与结构
• 1.4.2 ACTN3与肌纤维
• 1.4.3 ACTN3与ACTN2
• 1.4.4 ACTN3与其他
• 2.单核苷酸多态性概述
• 2.1 SNP的概念
• 2.2 常用的SNP检测方法
• 2.2.1 PCR-RFLP
• 2.2.2 PCR-SSCP
• 2.2.3 焦磷酸测序技术
• 3.启动子的研究方法
• 3.1 缺失分析
• 3.2 点突变分析
• 3.3 DNase Ⅰ足迹实验
• 3.4 凝胶阻滞实验
• 第二章 本研究的目的和意义
• 第三章 材料与方法
• 1.试验材料
• 1.1 试验动物、组织样品与性状测定
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 组织样品
• 1.1.3 性状测定
• 1.2 实验室仪器设备
• 1.3 常用试剂及试剂盒
• 1.4 常用溶液的配制
• 1.5 菌株、细胞系和载体
• 2.试验方法
• 2.1 猪基因组DNA的提取
• 2.2 总RNA的提取及cDNA的制备
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 总RNA的浓度测定和质量检测
• 2.2.3 cDNA的制备
• 2.3 部分cDNA序列、基因组序列的克隆测序
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 PCR反应体系及程序
• 2.3.3 PCR产物的检测
• 2.3.4 PCR产物的回收纯化、克隆和测序
• 2.3.4.1 PCR产物的回收纯化
• 2.3.4.2 载体连接
• 2.3.4.3 连接产物的转化
• 2.3.4.4 阳性克隆子的鉴定及测序
• 2.4 主要分子生物学工具
• 2.5 遗传效应分析
• 2.6 表达分析
• 2.6.1 RT-PCR组织表达谱分析
• 2.6.2 荧光定量PCR表达分析
• 2.7 启动子功能分析
• 2.7.1 引物设计
• 2.7.2 目的片段的双酶切
• 2.7.3 连接
• 2.7.4 重组质粒的原核表达及鉴定
• 2.7.5 质粒提取及双酶切鉴定
• 2.7.6 细胞培养和转染
• 2.7.6.1 细胞的复苏及培养
• 2.7.6.2 瞬时转染
• 2.7.6.3 荧光素酶相对活性测定与分析
• 第四章 结果与分析
• 1.猪总RNA提取、cDNA的制备与质量检测结果
• 1.1 猪总RNA提取与检测
• 1.2 cDNA的制备与质量检测结果
• 2. cDNA序列、基因组序列的克隆及生物信息学预测
• 2.1 部分cDNA序列的克隆
• 2.2 部分基因组序列的克隆
• 2.3 生物信息学分析
• 3. 猪ACTN3基因的SNPs研究
• 3.1 猪ACTN3基因第11外显子G418A多态位点
• 3.1.1 G418A位点TspE Ⅰ-RFLP分型方法的建立
• 3.1.2 G418A位点在不同猪品种中的基因型及基因频率分布
• 3.1.3 G418A位点与猪肉质性状、胴体性状的相关分析
• 3.2 猪ACTN3基因第19内含子A512G多态位点
• 3.2.1 A512G位点SacⅡ-RFLP分型方法的建立
• 3.2.2 A512G位点在不同品种中的基因型及基因频率分布
• 3.2.3 A512G位点与猪胴体、肉质性状的相关分析
• 4.猪ACTN3基因的表达分析
• 4.1 半定量组织表达谱分析
• 4.2 实时定量PCR时空表达分析
• 5. 猪ACTN3基因启动子的研究
• 5.1 启动子区的生物信息学分析
• 5.2 启动子区真核表达载体的构建
• 5.3 启动子重组质粒的活性测定及分析
• 第五章 讨论
• 1.基于EST克隆新基因
• 2.关于猪ACTN3基因的结构分析
• 3.关于猪ACTN3基因的SNPs检测及遗传效应分析
• 3.1 SNPs检测
• 3.2 遗传效应分析
• 4.关于猪ACTN3基因的表达分析
• 4.1 半定量RT-PCR组织表达谱分析
• 4.2 实时定量PCR时空表达谱分析
• 4.2.1 关于实时定量PCR
• 4.2.2 时空表达谱分析
• 5.关于猪ACTN3基因启动子结构及活性分析
• 5.1 猪ACTN3基因启动子结构分析
• 5.2 猪ACTN3基因启动子活性分析
• 6.关于启动子区表达载体的构建
• 7.下一步工作
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录