重组限制性内切酶I-SceI在毕赤酵母GS115中的表达与酶活性质研究

论文摘要

I-Scel是一种由内含子编码的归位内切酶,该内含子存在于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的线粒体中。内含子编码的内切酶是能够促使内含子在DNA水平上进行转移第一步的酶。它们识别和剪切同源等位基因的非内含子区域,然后通过双链剪切修复机制插入内含子,这样可以使受体等位基因也具有内含子。由于I-SceI具有的这些特点,在高分辨率的物理图谱,基因组组织分析,基因克隆和定点重组诱导,还有在多种多样的生物系统中双链突变修复的研究中,这种酶都能成为很有利的工具。目前商品化的I-SceI都是在大肠杆菌中诱导表达的,但是表达量不高,而且后续纯化步骤复杂。为了提高I-SceI的表达量,我们利用了外源蛋白表达量高,自身分泌表达蛋白少,易于分离纯化外源蛋白,便于高密度发酵的巴斯德毕赤酵母表达系统实现了I-SceI的分泌表达。首先我们合成了I-SceI基因（708bp）,然后将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A中,重组质粒经内切酶SalI线性化并用电转的方法转化毕到赤酵母菌株GS115中。经MD平板筛选和PCR鉴定出正确的转化子。对携带有I-SceI基因的重组GS115菌株进行摇瓶培养,经甲醇诱导后,收集上清,并对其进行SDS-PAGE分析,结果显示,该蛋白获得表达,表达量约为179mg/L。进一步的实验表明I-SceI能特异性的切割质粒Fast-spec上的两个I-SceI识别位点,证明重组I-SceI蛋白具有生物活性,而且I-SceI在毕赤酵母中成功表达。同时,我们将I-SceI的ORF与从来自硫磺矿硫化叶菌的Sso7d基因的ORF进行N端和C端融合,并利用巴斯德毕赤表达系统对两种融合蛋白进行了表达。两种蛋白都已获得成功表达,并且能够专一性识别Fast-spec质粒上的I-SceI位点,证明这两种蛋白都具有生物活性。更为重要的是融合Sso7d的I-SceI具有更高的切割效率。这可能是由于Sso7d改变了DNA的空间结构,从而使得I-SceI更容易作用于DNA上特异性位点。在进一步的工作中,我们拟进一步筛选高表达的Sso7d与I-SceI融合蛋白的毕赤酵母菌株,从而应用于工业生产中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1.1 归位内切酶I-SceI的研究概况
• 1.1.1 限制性内切酶的概念和命名
• 1.1.2 限制性内切酶的发现
• 1.1.3 限制与修饰现象与其系统的种类
• 1.1.4 限制内切酶产生的末端
• 1.1.5 归位内切酶I-SceI的概述
• 1.2 Sso7d蛋白的研究概况
• 1.2.1 古菌的界及多样性
• 1.2.2 古菌的应用价值
• 1.2.3 嗜热古细菌及其研究的意义
• 1.2.4 硫磺矿硫化叶菌的概述
• 1.2.5 Sso7d蛋白及应用进展
• 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 1.3.1 巴斯德毕赤酵母系统的概述
• 1.3.2 外源基因导入的方法
• 1.3.2.1 整合方式
• 1.3.2.2 转化方法
• 1.3.3 影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素
• 1.3.3.1 目的基因的特性
• 1.3.3.2 信号肽
• 1.3.3.3 宿主的生长状态、整合方式和转化子表型
• 1.3.3.4 培养条件
• 1.3.4 外源蛋白的糖基化作用
• 1.3.5 巴斯德毕赤酵母表达系统应用前景
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.1.1 菌株
• 2.1.1.2 质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂和工具酶
• 2.1.4 仪器和设备
• 2.1.5 主要缓冲液
• 2.1.5.1 质粒提取用缓冲液
• 2.1.5.2 琼脂糖凝胶电泳缓冲液
• 2.1.5.3 大肠杆菌感受态细胞制备用缓冲液
• 2.1.5.4 蛋白质提取用缓冲液
• 2.1.5.5 毕赤酵母转化与表达
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的基因Sso-I-SceI、I-SceI-Sso、I-SceI的合成
• 2.2.1.1 合成基因所需引物的设计
• 2.2.1.2 PCR扩增片段
• 2.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
• 2.2.1.4 vita-gene胶回收试剂盒回收DNA
• 2.2.1.5 Over-lapping PCR扩片段
• 2.2.1.6 PCR产物的T4 DNA聚合酶处理
• 2.2.2 毕赤酵母重组表达载体的构建
• 2.2.2.1 双酶切pHBM905A质粒
• 2.2.2.2 solution Ⅰ酶连
• 2.2.2.3 PCR鉴定重组质粒
• 2.2.3 毕赤酵母的电击转化及重组菌株的鉴定
• 2.2.3.1 限制性内切酶SalI处理重组质粒
• 2.2.3.2 毕赤酵母的电击转化
• 2.2.3.3 重组子的验证
• 2.2.4 重组限制性内切酶Sso-I-SceI,I-SceI-Sso和I-SceI的诱导表达及SDS-PAGE分析
• 2.2.4.1 外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达
• 2.2.4.2 SDS-PAGE检测表达蛋白
• 2.2.5 Bradford法测定蛋白质浓度测定
• 2.2.6 DNA质粒浓度的测定
• 2.2.7 糖基化分析
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的构建
• 3.2 毕赤酵母重组表达载体的构建
• 3.3 毕赤酵母的电击转化和重组菌株的鉴定
• 3.4 重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的诱导表达和SDS-PAGE分析
• 3.5 重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的蛋白质浓度测定
• 3.6 重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的酶活性和比活性测定
• 3.6.1 用于酶切的质粒Fast-spec介绍
• 3.6.2 实验方法
• 3.6.3 结果分析
• 3.7 重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的纯度分析
• 3.8 重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的糖基化分析
• 第四部分 讨论与展望
• 4.1 讨论
• 4.2 展望
• 4.2.1 筛选高表达的菌株
• 4.2.2 对融合有Sso7d的I-SceI酶性质研究
• 4.2.3 对目的蛋白进行糖基化分析
• 参考文献
• 致谢