生理切应力对与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞迁移的影响及其细胞骨架机制

论文摘要

血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）迁移（migration）是血管重建（remodeling）的主要特征之一,对于维持血管功能和结构的稳定具有重要作用。在血管发育、血管新生以及血管内膜损伤（如球囊损伤和动静脉移植）修复等过程中,均出现ECs的迁移。ECs迁移受生物、化学和物理等多种体内外因素的调控,研究ECs的迁移行为及其调控机制,阐明ECs迁移的力学生物学（mechanobiology）机制对于深入了解心血管活动和疾病发生的本质有重要意义,且可以为发展心血管疾病有效的防治措施提供理论依据。ECs和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是构成血管壁的主要细胞成分,生理状态下,这两种细胞本身相互影响,同时又不断的受到血液动力学的作用。因此,研究ECs的迁移行为,应该考虑相关的力学因素及VSMCs的影响。本文首先应用ECs与VSMCs联合培养系统,通过细胞粘附实验,观测了VSMCs对ECs粘附的影响及其机制。用免疫荧光法观测了ECs在粘附过程中,粘着斑（focal adhesions, FAs）的聚集;用全内反射荧光显微镜观测了粘附ECs的FAs面积变化;同时应用免疫印迹法检测了VSMCs对ECs的细胞骨架成分微管（microtubule）聚合程度、桩蛋白（paxillin）和胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase,ERK）磷酸化的影响。在此基础上,应用ECs与VSMCs联合培养的平行平板流动腔系统,对ECs面施加15 dynes/cm2切应力,以Transwell法检测ECs的迁移能力,免疫印迹法定量检测相关蛋白,研究了切应力对与VSMCs联合培养ECs迁移的影响及其细胞骨架机制,即组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）/乙酰化微管信号途径在其中的作用。结果发现:①与VSMCs联合培养明显促进了ECs的粘附和迁移,降低了ECs的微管骨架聚集,诱导了ECs的HDAC6、paxillin和ERK的磷酸化表达增高;②HDAC6抑制剂曲古抑菌素A （trichostatin A,TSA）和三丁酸甘油酯（tributyrin,TB）可改变微管的聚集状态,抑制VSMCs诱导的ECs粘附、迁移及HDAC6及ERK激酶、paxillin的激活;③生理范围切应力同样可以促进ECs迁移,诱导ECs的HDAC6表达,同时改变了微管骨架的乙酰化修饰水平;④生理切应力加载降低了与VSMCs联合培养ECs的迁移能力和HDAC6的表达及与ECs联合培养的VSMCs的CTGF的表达。上述结果表明,VSMCs能够促进ECs的粘附与迁移,而生理大小的切应力作为血管壁结构和功能的稳定因素,同样可以调控ECs的迁移,对血管壁起保护作用。切应力和VSMCs通过HDAC6影响ECs微管骨架动态聚集,经由ERK/paxillin信号通路,调控ECs迁移。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 与血管平滑肌细胞联合培养内皮细胞的粘附
• 1.1 引言
• 1.2 实验材料及仪器
• 1.2.1 实验仪器
• 1.2.2 试剂
• 1.2.3 主要溶液成分及配制
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 细胞培养与鉴定
• 1.3.2 ECs 和VSMCs（或FBs）的联合培养模型
• 1.3.3 实验分组
• 1.3.4 24 孔培养板的预处理
• 1.3.5 细胞粘附实验
• 1.3.6 细胞粘附抑制实验
• 1.3.7 蛋白提取
• 1.3.8 蛋白免疫印迹实验（western blot）
• 1.3.9 免疫荧光检测（confocal micracopy）
• 1.3.10 细胞FAs 面积的测定
• 1.3.11 多聚微管和微管单体的提取方法
• 1.3.12 统计学方法
• 1.4 实验结果
• 1.4.1 原代培养的ECs、VSMCs 和FBs 形态学观察及鉴定
• 1.4.2 VSMCs 诱导ECs 粘附
• 1.4.3 VSMCs 诱导ECs 的FAs 形成
• 1.4.4 VSMCs 促进 ECs 的FAs 面积增加
• 1.4.5 VSMCs 对ECs 微管聚合的影响
• 1.4.6 VSMCs 对ECs p-paxillin 和ERK1/2 MAPK 信号通路活化的影响
• 1.4.7 ERK1/2 MAPK 信号通路参与调节 VSMCs 诱导 ECs 的 paxillin 激活
• 1.4.8 TSA 改变微管稳定性，抑制VSMCs 诱导的ECs 粘附
• 1.4.9 TSA 抑制了VSMCs 对联合培养ECs 的ERK1/2 和 paxillin 活化
• 1.5 讨论
• 1.5.1 VSMCs 诱导ECs 粘附
• 1.5.2 与VSMCs 联合培养ECs 的粘附机制探讨
• 第2章 切应力对与血管平滑肌联合培养内皮细胞迁移的影响及其细胞骨架机制
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 主要溶液成分及配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.2 用于VSMCs 和ECs 联合培养的平行平板流动腔系统
• 2.3.3 实验分组
• 2.3.4 细胞迁移实验
• 2.3.5 HDAC6 RNA 干扰实验
• 2.3.6 蛋白提取
• 2.3.7 蛋白免疫印迹实验
• 2.3.8 统计学方法
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 切应力和VSMCs 可以诱导ECs 的迁移
• 2.4.2 VSMCs 诱导ECs 的HDAC6 激活
• 2.4.3 HDAC6 的表达改变伴有微管乙酰化水平降低
• 2.4.4 VSMCs 对ECs 中HDAC6 和微管乙酰化表达的影响呈时间依赖性
• 2.4.5 HDAC6 和微管乙酰化调控ECs 的迁移
• 2.4.6 切应力抑制与ECs 联合培养的VSMCs 的CTGF 的表达
• 2.5 讨论
• 2.5.1 切应力对与VSMCs 对联合培养ECs 迁移的影响
• 2.5.2 VSMCs 对ECs 迁移的调控途径
• 2.5.3 切应力对ECs 迁移的调控机制
• 全文小结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间已发表和修回的学术论文