流感病毒包膜蛋白M2免疫防护能力和防护机制研究

论文摘要

流感的流行给人类健康带来很大的危害,这就迫切要求开发出具有广谱防护效果的流感疫苗。流感病毒包膜蛋白M2因其高度保守性而成为疫苗研制的重要靶蛋白。在本论文中,我们重点研究了流感病毒M2蛋白胞外区（M2e）的免疫防护能力和防护机制,并取得了以下创新性研究成果。我们发现流感M2e具有很强的免疫原性,合成的M2e多肽无需载体蛋白就能诱导产生高滴度的特异性抗体,并且在攻毒实验中能保护小鼠免于致死剂量流感病毒的攻击。此外,研究发现M2e多肽能诱导产生特异性的T细胞反应,从而证明了在流感病毒M2e上存在Th细胞表位。这些研究成果部分阐明了流感病毒M2蛋白的免疫防护机制。研究发现利用定点突变的方法将M2e多肽上的半胱氨酸残基替换成丝氨酸后不会影响M2e多肽的抗原性,但会显著降低其免疫原性,丧失诱导产生特异性免疫应答的能力。此外,我们还发现M2e多肽可以通过半胱氨酸残基形成的链间二硫键交联形成多聚体。这表明M2e的半胱氨酸残基对维持其免疫原性起到关键作用。为了探讨M2蛋白诱导的免疫应答与病毒防护效果之间的关系,我们利用添加CpG-ODN佐剂的方法来影响M2e多肽诱导产生的免疫应答。研究发现在M2e多肽中加入CpG-ODN能显著提高其诱导产生的抗体水平和T细胞反应,并且促进免疫反应向Th1型发展。但是免疫应答的增强反而降低了高剂量病毒攻击时的防护效果。我们将M2e多肽与传统的裂解疫苗联合免疫,以增强裂解疫苗对不同亚型毒株的交叉防护能力。研究发现M2e多肽与裂解疫苗的联合免疫不会影响血凝抑制抗体的产生,但是佐剂的使用对联合免疫诱导的M2e特异性免疫应答有重要影响。在铝佐剂中,联合免疫能诱导产生M2e特异性的免疫应答,而在MF59佐剂中却无此效果。此外,疫苗诱导的交叉防护效果也受所用佐剂的影响。在铝佐剂中,加入M2e多肽能提高裂解疫苗的交叉防护效果,而在MF59佐剂中反而降低其交叉防护能力。这些研究结果提示M2实验疫苗的防护效果也与佐剂的配伍相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 流行性感冒概况
• 1.2 流感病毒生物学特点
• 1.3 流感病毒预防和治疗方法
• 1.3.1 抗流感病毒药物
• 1.3.2 流感疫苗
• 1.3.3 流感预防和治疗的困境
• 1.4 基于流感病毒M2 蛋白胞外区研制广谱流感疫苗
• 1.5 本论文的研究目的与研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 流感病毒传代、滴度测定及初步纯化
• 2.3 SDS-PAGE 检测病毒蛋白
• 2.4 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
• 2.5 动物免疫及血清制备
• 2.6 抗血清的ELISA 检测
• 2.7 抗血清中M2e 特异性抗体的亚型鉴定
• 2.8 流式细胞检测（FACS）
• 2.9 ELISPOT
• 2.10 流感病毒攻击实验
• 第3章 流感病毒M2 蛋白胞外区的免疫原性
• 3.1 本章引言
• 3.2 结果
• 3.2.1 M2e 多肽诱导产生高滴度的M2e 特异性抗体
• 3.2.2 M2e 多肽诱导的抗血清识别病毒感染的MDCK 细胞
• 3.2.3 M2e 多肽诱导产生的特异性抗体以IgG1 亚型为主
• 3.2.4 M2e 多肽诱导活化M2e 特异性T 细胞
• 3.2.5 M2e 多肽诱导产生对流感病毒的防护效果
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 第4章 半胱氨酸残基对M2 蛋白胞外区免疫原性的影响
• 4.1 本章引言
• 4.2 结果
• 4.2.1 Cys 的突变不影响M2e 的B 细胞表位
• 4.2.2 Cys 的突变不影响M2e 的T 细胞表位
• 4.2.3 Cys 的突变显著降低M2e 的免疫原性
• 4.2.4 M2e 多肽通过链间二硫键形成多聚体
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 第5章 CpG-ODN 对M2e 免疫防护效果的影响
• 5.1 本章引言
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 CpG-ODN 增强M2e 诱导的抗体应答
• 5.2.2 CpG-ODN 增强M2e 特异性Th1 型细胞反应
• 5.2.3 CpG-ODN 不能增强M2e 诱导的病毒防护活性
• 5.3 讨论
• 5.4 本章小结
• 第6章 M2e 与裂解病毒疫苗联合免疫
• 6.1 本章引言
• 6.2 实验结果
• 6.2.1 M2e 多肽在裂解疫苗所用佐剂中的免疫原性
• 6.2.2 M2e 多肽在裂解疫苗所用佐剂中能诱导病毒防护效果
• 6.2.3 裂解疫苗的制备及联合免疫方案
• 6.2.4 联合免疫不影响血凝抑制（HI）抗体的产生
• 6.2.5 佐剂影响联合免疫中 M2e 特异性的免疫应答
• 6.2.6 佐剂影响联合免疫对不同亚型毒株的防护效果
• 6.3 讨论
• 6.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果