对硫磷半抗原分子设计研究

论文摘要

半抗原的分子设计与合成是建立小分子免疫化学分析方法的关键步骤,也是开展免疫化学研究的核心内容。本研究选取代表性有机磷杀虫剂对硫磷作为研究对象,通过研究农药半抗原结构与由其制备的免疫原的免疫活性之间的结构—活性关系（Structure Activity Relationship,SAR）,探索了影响抗原免疫活性的一般规律,初步建立了免疫半抗原合理设计模型。研究采用分子结构参数化的方法,引入分子连接性指数法和分子模拟法设计农药免疫半抗原分子结构,计算了设计的42个免疫半抗原分子与对硫磷之间的欧氏距离,根据欧氏距离的大小来判定分子结构之间的相似性,并通过平衡透析和ELISA测定对计算结果进行验证和比较。研究表明分子连接性指数法适于表征半抗原的立体结构而对电性结构表现不足;分子模拟法则相反,能较好地表征半抗原分子结构的电性参数,这两种方法的结合能够更好地表征半抗原与目标化合物之间的分子相似度。因此采用分子连接性指数（MGI）与电性参数（EP）结合的方法建立了相应的分子设计模型,该模型能够较好地指导小分子农药免疫半抗原的分子设计。在采用MCI+EP的方法建立小分子农药免疫半抗原分子设计模型的基础上,进一步探讨了小分子农药竞争半抗原分子设计原则。首次提出了目标物（P）、免疫半抗原（I）、竞争半抗原（C）之间关系的三角形模型理论:CP＞CI,即CP—CI＞0;Max（CP-IP）,且CP＞IP,即CP—IP＞0;Max（CI）。同时结合异源ELISA方法及其结果,研究建立竞争半抗原分子结构与其反应原性之间的SAR关系后,提出了小分子农药竞争半抗原分子设计模型,并进一步提出了三角模型的临界条件CI=2-4;CP=1-4。然后采用竞争半抗原（hapten 0325）对提出的竞争半抗原分子设计模型及其临界条件进行了验证。根据研究建立的免疫半抗原/竞争半抗原分子设计模型,在设计的42个半抗原中,筛选出0204/0322的组合,标准曲线方程为:y=10.012Ln（x）+32.768,IC50为5.60 ng/mL,IC10为0.10 ng/mL。进一步研究了免疫半抗原/竞争半抗原优化组合对ELISA分析方法的影响,结果表明:0204/0322组合的异源ELISA方法异源分析方法对对硫磷的检测灵敏度高于同源分析,以IC10计,0204/0322组合相对于同源方法,灵敏度提高了16.1倍,而且该异源ELISA方法与仪器分析结果具有可比性。0204/0322组合建立的异源竞争ELISA方法对对硫磷的其它结构类似物的交叉反应率基本小于0.05%,仅甲基对硫磷为7.8%,对氧磷为2.5%。该方法应用于水、土壤、黄瓜、大米和玉米样品中对硫磷的残留检测,结果表明其检测能力均符合农药残留检测准则的要求。最后选取三唑磷、2,4,5-三氯苯酚和倍硫磷作为对象,对本研究提出的免疫半抗原和竞争半抗原分子设计模型进行了验证,实验数据来源均为其它研究者公开发表文章。模型验证结果证明了免疫半抗原和竞争半抗原分子设计模型的适用性和正确性,可以采用免疫半抗原分子设计模型配合合理抗体制备获得高亲和力的抗体,同时将竞争半抗原分子设计模型应用于小分子农药竞争半抗原设计,可以预测最佳竞争半抗原结构,从而提高方法的灵敏度。免疫半抗原和竞争半抗原分子设计模型的建立,对于解决目前半抗原设计从经验或是合成的难易出发而导致半抗原数量不足与设计角度的随意性,致使结果的代表性不足,不能找到半抗原合理设计的一般规律等问题具有很好的指导作用。本研究实现了半抗原的定量化、导向性设计。尤其是竞争半抗原分子设计模型的建立,对于提高免疫分析方法的特异性和灵敏度有重要意义。半抗原分子设计模型的建立将有助于丰富和完善农药残留免疫化学分析方法的基本理论,对于进一步开发农药等小分子化合物残留快速诊断技术有着十分重要的意义。

论文目录

• 致谢
• 术语和缩略语表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.免疫分析技术在农药残留检测中的应用
• 2.半抗原分子设计的一般策略
• 2.1 半抗原的内涵
• 2.2 半抗原的分类
• 2.3 半抗原的分子设计原则
• 3.半抗原合理设计对免疫分析方法的影响
• 4.分子模拟技术在半抗原设计中的应用
• 5.分子连接性指数法应用研究进展
• 5.1 分子连接性指数的提出和发展
• 5.2 分子连接性指数在SAR/QSAR中的应用
• 5.2.1 分配系数与分子连接性
• 5.2.2 色谱保留指数与分子连接性
• 5.2.3 生物活性与分子连接性
• 6.立题依据
• 第二章 免疫半抗原分子设计与免疫原SAR研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 试剂与药品
• 1.2 缓冲液
• 1.3 仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 半抗原的设计与合成
• 2.2 半抗原的合成
• 2.3 人工抗原的合成
• 2.4 包被原的合成
• 2.5 半抗原和人工抗原结构的鉴定
• 2.5.1 PA半抗原的分子结构鉴定
• 2.5.2 人工抗原的鉴定及结合比的测定
• 2.6 免疫半抗原的SAR
• 2.6.1 分子连接性指数在免疫半抗原SAR研究中的应用
• 2.6.2 电性参数的计算
• 2.7 分子相似度的定量表达
• 2.8 多抗的制备
• 2.8.1 实验动物的选择
• 2.8.2 PA人工抗原的乳化及免疫方案
• 2.8.3 采血与抗血清效价测定
• 2.8.4 抗体的纯化及冻干粉效价测定
• 2.9 农药—抗体亲和力的测定
• 2.10 农药—抗体亲和力的计算
• 2.11 PA对每种抗体抑制率的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 半抗原的设计与合成
• 3.2 抗血清与冻干粉效价的测定
• 3.3 MCI在免疫半抗原SAR研究中的应用
• 3.3.1 MCI的计算结果
• 3.3.2 利用MCI计算分子相似度
• 3.4 分子模拟在免疫半抗原SAR研究中的应用
• 3.4.1 电性参数计算结果
• 3.4.2 利用电性参数计算分子相似度
• 3.5 MCI与EP法在免疫半抗原SAR研究中的应用比较
• 3.6 免疫半抗原SAR结果
• 3.7 SAR结果验证
• 3.8 免疫半抗原SAR设计模型
• 4.小结与讨论
• 第三章 竞争半抗原分子设计与竞争原SAR研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 竞争半抗原分子结构参数的表达和计算
• 2.2 分子相似度的计算
• 2.3 间接竞争ELISA实验
• 2.4 抗原—抗体亲和力的测定
• 2.5 抗原—抗体亲和力的计算
• 3 结果与分析
• 3.1 竞争半抗原分子的MCI和EP参数
• 3.2 竞争半抗原分子相似度的计算
• 3.3 竞争半抗原三角模型的建立
• 3.4 竞争半抗原SAR结果验证
• 3.5 竞争半抗原三角模型的临界条件
• 3.6 竞争半抗原三角形模型确证
• 3.7 竞争半抗原分子设计模型
• 4.免疫半抗原—竞争半抗原优化组合对ELISA方法质量的影响
• 4.1 免疫半抗原—竞争半抗原优化组合对ELISA方法亲和性的影响
• 4.2 免疫半抗原—竞争半抗原优化组合对ELISA方法特异性的影响
• 4.3 免疫半抗原—竞争半抗原优化组合对ELISA方法检测实际样品能力的影响
• 5.小结与讨论
• 第四章 半抗原分子设计模型的初步验证
• 1.半抗原分子设计模型在三唑磷ELISA分析方法中的使用
• 1.1 三唑磷半抗原分子设计
• 1.2 免疫半抗原设计模型在三唑磷免疫半抗原设计中的应用
• 1.2.1 参数的计算和挑选结果
• 1.2.2 欧式距离的计算
• 1.2.3 模型计算结果与实验结果对比
• 1.3 竞争半抗原设计模型在三唑磷竞争半抗原设计中的应用
• 1.3.1 欧式距离的计算
• 1.3.2 模型计算结果与实验结果对比
• 1.4 讨论和结论
• 2.半抗原分析设计模型在三氯苯酚ELISA分析方法中的使用
• 2.1 半抗原设计
• 2.2 免疫半抗原设计模型在三氯苯酚免疫半抗原设计中的应用
• 2.2.1 参数的计算和挑选结果
• 2.2.2 欧式距离的计算
• 2.2.3 模型计算结果与实验结果对比
• 2.3 竞争半抗原设计模型在三氯苯酚竞争半抗原设计中的应用
• 2.3.1 欧式距离的计算
• 2.3.2 模型计算结果与实验结果对比
• 2.4 讨论和结论
• 3.半抗原分析设计模型在倍硫磷ELISA分析方法中的使用
• 3.1 半抗原设计
• 3.2 免疫半抗原设计模型在倍硫磷免疫半抗原设计中的应用
• 3.2.1 参数的计算和挑选结果
• 3.2.2 欧式距离的计算
• 3.2.3 模型计算结果与实验结果对比
• 3.3 竞争半抗原设计模型在倍硫磷竞争半抗原设计中的应用
• 3.3.1 欧式距离的计算
• 3.3.2 模型计算结果与实验结果对比
• 3.4 讨论和结论
• 第五章 总结与讨论
• 1.主要结论
• 2.创新点
• 3.不足与展望
• 3.1 本研究的不足
• 3.2 研究展望
• 参考文献
• 在校期间取得成果