棉属野生种旱地棉（Gossypium aridum）耐盐相关基因的分离与鉴定

论文摘要

目前全球受盐碱化影响的耕作土地约占世界总耕地面积的20%,然而由于全球气候的变化及不合理的灌溉方式,使这一数字有进一步扩大的趋势。棉花是世界上最重要的纤维作物和油料作物之一,属中等耐盐作物,是盐碱地先锋作物,但当土壤含盐量超过0.3%时,棉花的生长发育就会受到严重的抑制。由于现有棉花栽培品种耐盐水平总体不高,而且基础种质相对集中,使棉花在盐碱地的推广受到极大限制。棉属野生种种质资源丰富,且包含众多优异等位基因。前人报道D染色体亚组的旱地棉（Gossypium aridum）具有较强的耐盐性。本研究以棉属野生种旱地棉为材料,以盐敏感栽培种苏12为对照,通过对野生种盐胁迫下的转录组的分析,鉴定与棉花野生种旱地棉耐盐相关基因,分析各基因在盐胁迫下可能起到的作用,探讨棉属野生种的耐盐性机理。研究结果如下：1.利用cDNA-AFLP技术分离出了旱地棉/戴维逊氏棉盐胁迫下的25个表达差异片段（TDFs）.利用电子克隆方法,将这些差异片段与棉花已知EST序列进行拼接。拼接结果经NCBI中Blast程序分析表明,大部分片段都与植物抗逆基因同源,其中与代谢过程相关的基因片段所占比例最大,为24%,与细胞生长发育相关基因,膜蛋白基因及渗透调节基因同源的片段次之,各占12%,与细胞信号转导基因,转录调控基因,转运蛋白基因及未知基因同源的片段,各占8%,与活性氧清除及具有大分子保护功能的基因同源的片段最少,各占4%。利用半定量RT-PCR鉴定了其中9个TDFs在旱地棉不同组织及经不同盐胁迫时间下的叶片中表达情况。结果表明大部分基因片段都受到盐胁迫的诱导表达,部分TDFs有较强的组织差异表达特性。2.利用电子克隆技术及GenomeWalking技术获得了旱地棉三个耐盐相关全长基因,机械敏感离子通道类蛋白（GarMSL）,细胞色素类蛋白（GarCYP）,苏氨酸醛缩酶类蛋白（GarTHA）。GarMSL基因编码707个氨基酸,理论分子量78.26kDa,与拟南芥AtMSL2基因同源率为60.92%；其基因组结构包含13个外显子和12个内含子；根据其内含子中SSR分析结果,GarMSL基因在A,D基因组内各有一个拷贝；启动子区域包含赤霉素,及茉莉酸响应调控元件；蛋白结构分析表明该蛋白包含5个跨膜区域。GarCYP基因编码509个氨基酸,与杨树PtCYP98A27基因同源率为88.61%,理论分子量为57.80kDa,启动子序列分析表明GarCYP基因启动子区包含乙烯响应元件（ERE）,水杨酸响应元件（TCA-element）. GarTHA基因在第6个外显子区域存在可变剪切机制,GarTHA1基因编码358个氨基酸,38.19kDa, GarTHA2编码273个氨基酸,28.75kDa。根据同源基因AtTHA1基因在ATTED及eFP中的分析结果表明,该类基因可能参与了植物抗逆调控网络。3.利用农杆菌介导的转基因技术,将35S及逆境胁迫特异启动子RD29A启动的GarMSL、GarCYP和GarTHA1基因分别转入烟草,初步结果表明过量表达GarMSL与GarCYP基因的烟草较胁迫特异启动子RD29A启动表达的烟草生长发育明显受到抑制,生育期延长。而这两类转基因烟草愈伤组织在盐胁迫下的存活率较对照高,证明这两个基因可能参与了棉花耐盐过程。过量表达GarTHAl基因对于提高烟草耐盐性的效果不明显。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文縮略词
• 第一部分 文献综述
• 1 非生物胁迫下植物的应对机理
• 1.1 植物胁迫信号的感应及转导
• 1.2 ABA与植物抗胁迫
• 1.2.1 ABA受体
• 1.2.2 ABA的代谢与植物逆境胁迫的关系
• 1.2.3 依赖ABA的信号转导及基因表达
• 2+及其相关蛋白'>1.3 Ca²⁺及其相关蛋白
• +转运及耐盐过程'>1.3.1 CBL-CIPK途径调节Na⁺转运及耐盐过程
• 1.3.2 CBL-CIPK途径与K+的流入
• 1.4 磷脂信号转导在逆境条件下的作用
• 1.5 活性氧（ROS）
• 2 逆境胁迫下的植物基因表达调控
• 2.1 转录因子在植物逆境下的调控作用
• 2.2 逆境下非依赖于ABA的基因表达调控
• 2.2.1 DREB1与DREB2
• 2.2.2 其它类型非依赖ABA基因表达调控
• 2.3 逆境下依赖于ABA的基因表达调控
• 3 植物逆境下表观遗传组的变化
• 3.1 基因组DNA的甲基化
• 3.2 组蛋白的修饰
• 3.3 smRNA
• 3.4 RNA可变性剪接机制
• 4 逆境下植物差异表达基因的分离方法
• 4.1 差异表达PCR（DD-PCR）
• 4.2 cDNA-AFLP法
• 4.3 缩减杂交
• 4.4 微阵列
• 4.5 SAGE
• 4.6 电子克隆
• 4.7 图位克隆
• 5 植物耐盐基因的克隆及应用
• 5.1 与盐胁迫下的信号转导途径相关的基因
• 5.2 与离子转运及离子平衡相关的基因
• 5.3 参与渗透保护物质的生物合成类基因
• 5.4 其它耐盐胁迫的相关基因
• 6 棉花的耐盐机制
• 6.1 棉花耐盐水平
• 6.2 棉花耐盐机制
• 6.3 棉花耐盐种质资源
• 6.4 棉花耐盐基因的研究现状
• 7 本研究的主要内容、意义及技术思路
• 7.1 研究意义与内容
• 7.2 技术路线
• 第二部分 研究报告
• 第一章 利用cDNA-AFLP技术分离盐胁迫下棉花野生种叶片中特异基因片段
• 引言
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种
• 2 仪器设备和试剂
• 2.1 仪器与设备
• 2.2 试剂
• 3 实验方法
• 3.1 植物材料处理方法
• 3.2 双链cDNA的合成
• 3.2.1 RNA提取
• 3.2.2 cDNA第一链的合成
• 3.2.3 cDNA第二链的合成
• 3.3 cDNA-AFLP的方法步骤
• 3.3.1 酶切体系（20μl体系）
• 3.3.2 连接体系（15μl体系）
• 3.3.3 预扩增
• 3.3.4 选择性扩增
• 3.4 凝胶分析
• 3.4.1 制胶
• 3.4.2 电泳
• 3.4.3 银染方法
• 3.5 特异片段的回收测序
• 3.5.1 特异片段的回收
• 3.5.2 将特异片段连入T载体并测序
• 3.5.3 特异片段的电子延伸
• 3.6 RT-PCR验证相关基因片段的表达状况
• 4 实验结果与分析
• 4.1 盐胁迫下差异表达片段的筛选与分离
• 4.2 特异EST片段电子延伸结果
• 4.3 部分片段的RT-PCR检测及分析
• 5 讨论
• 第二章 棉属野生种早地棉耐盐相关基因GarMSL,GarCYP,GarTHA全长基因的克隆
• 引言
• 1 实验材料、仪器与试剂（同第一章）
• 2 实验方法
• 2.1 旱地棉幼苗的培养与处理（同第一章）
• 2.2 染色体步行（GenomeWalking）的方法
• 2.2.1 旱地棉总基因组DNA的提取
• 2.2.2 GenomeWalking方法步骤
• 3 结果与分析
• 3.1 类机械敏感离子通道基因（mechanosensitive channel of small conductance like,MscS-like）的克隆
• 3.1.1 GarMSL基因序列的分析
• 3.1.2 GarMSL蛋白序列的分析
• 3.2 GarCYP基因的克隆与生物信息学分析
• 3.2.1 GarCYP基因序列分析
• 3.2.2 GarCYP基因启动子区域分析
• 3.3 旱地棉苏氨酸醛缩酶（THA）基因的初步分析
• 3.3.1 GarTHA基因序列的分析
• 3.3.2 GarTHA基因蛋白序列的分析
• 3.3.3 GarTHA基因可能的功能预测
• 4 结论及讨论
• 第三章 GarMSL,GarCYP,GarTHA基因功能的初步鉴定
• 引言
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种和质粒
• 2 仪器设备与试剂
• 3 实验方法
• 3.1 35S植物表达载体
• 3.1.1 设计引物
• 3.1.2 载体的构建
• 3.2 拟南芥逆境特异启动子RD29A表达载体的构建
• 3.3 根癌农杆菌介导烟草转基因
• 3.3.1 准备工程菌
• 3.3.2 烟草转化
• 3.3.3 转基因烟草的分子检测
• 3.3.4 转基因烟草耐盐性的初步鉴定
• 4 实验结果
• 4.1 相关载体酶切检测
• 4.2 转基因烟草的分子检测
• 4.3 转基因植株的形态观察及耐盐性的初步分析
• 5 讨论
• 全文结论与创新点
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士研究生期间发表的学术论文
• 致谢