乳腺癌患者髓系来源抑制细胞的临床意义及相关免疫耐受机制探讨

论文摘要

目的:探讨乳腺癌患者肿瘤组织中髓系来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）的临床意义;建立正常人髓系CD33+细胞与乳腺癌细胞系体外共培养系统,模拟肿瘤局部MDSC的诱导过程,初步观察STAT3/IDO途径在MDSC下调T细胞免疫中的作用。方法:收集天津肿瘤医院35例乳腺癌根治术的手术切除标本,制成单细胞悬液,应用流式细胞术检测其中MDSC（Linl-CD33+CD13+CD14-CD15-）比例,分析MDSC的比例与患者临床病理特点（如:年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、临床分期、淋巴结转移、组织学分级、ER、PR、Her-2等）的相关性。收集健康供者的外周血,免疫磁珠的方法分选其中的CD33+细胞,体外与乳腺癌细胞系MDA-MB-231共孵育诱导MDSC,以单独培养CD33+细胞为对照组,培养2天后分别收获实验组MDSC及对照组CD33+细胞,流式细胞仪检测细胞表型;免疫磁珠法分选健康供者外周血中自体T淋巴细胞,设对照组为T细胞单独培养组及新鲜CD33+细胞与T细胞共孵育组,实验组为MDSC与T细胞共孵育组及MDSC与T细胞共孵育同时加入IDO抑制剂1-MT组,共孵育过夜后,Annexin V染色法检测MDSC对T细胞促凋亡作用,并观察IDO在MDSC诱导T细胞凋亡中的作用;收集各组的细胞培养上清,ELISA法检测MDSC诱导T细胞分泌细胞因子（IL-4,IL-10,IL-12,IFN-Y,TGF-β）的情况;实时定量PCR和Western blotting方法分别检测IDO和STAT3的表达与活化情况。结果:乳腺癌患者肿瘤组织中MDSC的比例与临床分期、淋巴结转移有关,Ⅲ期患者MDSC比例为（11.70±7.85）%高于Ⅰ/Ⅱ期患者（5.32±4.59）%,发生3个以上淋巴结转移的患者MDSC比例为（10.97±7.87）%高于3个以下（含3个）淋巴结转移的患者（5.86±5.26）%,差别均具有统计学意义（P<0.05）,未观察到MDSC比例高低与患者年龄、病理类型、肿瘤直径、组织学分级、ER、PR、Her-2表达有关（P>0.05）。正常人CD33+细胞与MDA-MB-231共孵育2天后,检测到一群表型为Lin1-CD33+CD13-CD14-CD15-的MDSC,T细胞单独培养组凋亡率为（6.10±1.76）%,新鲜CD33+细胞组T细胞凋亡率为（18.53±2.58）%,MDSC组T细胞凋亡率为（38.20±1.70）%,1-MT组T细胞凋亡率为（22.52±2.48）%。MDSC组T细胞凋亡率较对照组均升高,而1-MT组明显降低,差别均具有统计学意义（P<0.05）。T细胞与MDSC共孵育组TGF-β、IL-10分泌水平显著高于T细胞单独培养组、T细胞与新鲜CD33+细胞共孵育组,1-MT组TGF-β、IL-10分泌水平低于T细胞单独培养组、T细胞与MDSC共孵育组。T淋巴细胞与MDSC共孵育组IFN-Y分泌水平显著低于T细胞单独培养组、T细胞与新鲜CD33+细胞共孵育组,1-MT组IFN-Y分泌水平高于T细胞与MDSC共孵育组（P<0.05）,各组IL-4、IL-12分泌水平差异无统计学意义（P>0.05）。体外诱导的MDSC中IDO、STAT3 mRNA及蛋白表达增加、STAT3蛋白磷酸化增强,经过STAT3磷酸化抑制剂JSI-124预处理后,MDSC中IDO蛋白表达明显降低。结论:MDSC增多可能是导致乳腺癌患者发生淋巴结转移和疾病进展的重要影响因素。肿瘤细胞可通过非膜接触性的方式诱导正常CD33-髓系细胞分化为具有显著T细胞抑制活性的MDSC,其中STAT3磷酸化导致的IDO表达和活性的升高是MDSC抑制T细胞免疫的关键机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、乳腺癌患者肿瘤组织中MDSC的临床意义
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 对象
• 1.1.2 材料
• 1.1.3 设备
• 1.1.4 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 乳腺癌患者肿瘤组织中MDSC比例与临床病理特点的关系
• 1.3 讨论
• 1.3.1 MDSC定义、免疫功能及表型
• 1.3.2 肿瘤患者MDSC的临床意义
• 1.3.3 靶向MDSC抗肿瘤治疗
• 1.4 小结
• 二、体外诱导MDSC及STAT3/IDO途径在MDSC下调T细胞免疫中的作用
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 对象
• 2.1.2 材料
• 2.1.3 设备
• 2.1.4 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 流式细胞仪检测细胞表型变化
• 2.2.2 Annexin V-FITC法检测MDSC诱导T细胞凋亡
• 2.2.3 ELISA检测结果
• 2.2.4 实时定量PCR检测MDSC中IDOmRNA、STAT3mRNA表达
• 2.2.5 Western blotting检测MDSC中IDO、STAT3及p-STAT3蛋白表达
• +细胞后IDO蛋白检测'>2.2.6 JSI-124预处理CD33⁺细胞后IDO蛋白检测
• 2.3 讨论
• 2.3.1 MDSC产生、扩增及活化的机制
• 2.3.2 MDSC诱导分化
• 2.3.3 MDSC免疫抑制功能的机制
• 2.3.4 STAT3/IDO途径在肿瘤MDSC下调T细胞免疫中的作用
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 髓系来源抑制细胞的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢